四川大學(xué)劉建全課題組揭示植物水淹低氧適應(yīng)的新機(jī)制
時間：2021-04-06 10:48:29學(xué)院：生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院學(xué)校：四川大學(xué)
洪澇災(zāi)害是我國發(fā)生頻率極高、影響范圍極大，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的自然災(zāi)害之一。洪澇災(zāi)害對植物有多重壓力，最顯著的應(yīng)為水淹導(dǎo)致的低氧脅迫；其已成為生態(tài)學(xué)研究中最重要的科學(xué)問題之一，但對這一脅迫適應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制仍然不清楚。
近日，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉建全課題組在New Phytologist在線發(fā)表了題為 WRKY33 interacts with WRKY12 protein to up-regulate RAP2.2 during submergence induced hypoxia response in Arabidopsis thaliana 的研究論文，揭示了WRKY33/WRKY12-RAP2.2分子模塊調(diào)控?cái)M南芥水淹低氧適應(yīng)的新機(jī)制。
該研究用黑暗水淹處理模擬洪澇災(zāi)害脅迫導(dǎo)致的低氧環(huán)境，利用多種分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)等方法闡明擬南芥WRKY33/WRKY12-RAP2.2分子功能模塊參與水淹脅迫的分子生物學(xué)過程。該研究發(fā)現(xiàn)，與野生型Col相比較，過表達(dá) WRKY33 基因的擬南芥材料呈現(xiàn)出明顯的抗水淹脅迫的表型，例如存活率增加，葉片損傷較小，過氧化物積累少，MDA累積少，低氧響應(yīng)marker基因表達(dá)上調(diào)等；與之相反， wrky33 突變體在水淹處理后則呈現(xiàn)相對應(yīng)的一系列不抗水淹脅迫的表型。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WRKY33 基因能夠正調(diào)控水淹引起的缺氧脅迫。進(jìn)一步利用酵母雙雜交、BiFC、pull-down 和 Co-IP 實(shí)驗(yàn) 在分子水平上 闡釋了WRKY33 能與WRKY12蛋白相互作用，表型分析發(fā)現(xiàn) WRKY12 基因同樣能夠正調(diào)控水淹引起的缺氧脅迫。
研究人員進(jìn)一步通過對低氧響應(yīng)核心轉(zhuǎn)錄因子 ERF-VIIs 亞家族基因的啟動子分析，發(fā)現(xiàn)有四個成員 （RAP2.2, RAP2.12，HRE1,HRE2） 具有WRKY轉(zhuǎn)錄因子的順式作用元件W-box。同時檢測了上述四個基因水淹脅迫處理時在WRKY33以及WRKY12的突變體以及過表達(dá)中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)只有RAP2.2基因的表達(dá)與WRKY33以及WRKY12的表達(dá)直接相關(guān)，進(jìn)一步的EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RAP2.2 是WRKY33和WRKY12的直接靶標(biāo)。通過qRT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)，研究人員分別檢測了WRKY33、WRKY12和RAP2.2基因在水淹處理期間的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WRKY33和WRKY12比RAP2.2更早響應(yīng)水淹脅迫誘導(dǎo)的低氧，且三者呈現(xiàn)出相似的表達(dá)趨勢。以上結(jié)果皆暗示了WRKY33和WRKY12對 RAP2.2可能的調(diào)節(jié)作用。通過遺傳雜交獲得wrky12wrky33雙突變體、WRKY12-OEWRKY33-OE雙過表達(dá)擬南芥材料并進(jìn)行水淹表型分析發(fā)現(xiàn)，wrky12wrky33雙突變體相比其各自單突變體及野生型顯示出不耐水淹脅迫的表型，而WRKY12-OEWRKY33-OE雙過表達(dá)植物則顯示出最強(qiáng)的耐水淹脅迫抗性，利用二者進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同時表明WRKY12 和WRKY33共同存在能夠增強(qiáng)對RAP2.2的調(diào)控。ChIP，Dual-LUC等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，WRKY33 和WRKY12互作增強(qiáng)對RAP2.2 啟動子 結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性。通過遺傳雜交，獲得 wrky12RAP2.2-OE 和 wrky33RAP2.2-OE 擬南芥材料并進(jìn)行水淹表型分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) RAP2.2 能分別恢復(fù) wrky12 和 wrky33 突變體的水淹脅迫表型。以上分子和遺傳實(shí)驗(yàn)表明WRKY12 和 WRKY33 基因能夠協(xié)同發(fā)揮功能調(diào)控下游靶基因 RAP2.2 的表達(dá)，從而正調(diào)控水淹脅迫響應(yīng)。
研究人員還發(fā)現(xiàn)，WRKY33啟動子區(qū)-685bp 處含有一個ERF-VIIs轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的低氧響應(yīng)元件HRPE （hypoxia-responsive promoter element） 。分子和遺傳實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明RAP2.2可通過結(jié)合HRPE元件正調(diào)控WRKY33基因表達(dá)發(fā)揮反饋調(diào)控作用。EMSA，ChIP 和 Dual-LUC 實(shí)驗(yàn)在分子水平上表明RAP2.2直接正調(diào)控WRKY33基因的表達(dá)。對rap2.2 突變體和WRKY33-OE擬南芥材料雜交獲得rap2.2WRKY33-OE株系，進(jìn)一步的表型分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)WRKY33能部分恢復(fù) rap2.2突變體的水淹脅迫敏感表型。以上實(shí)驗(yàn)從遺傳上表明RAP2.2可在WRKY33 的上游起作用，形成環(huán)式級聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
WRKY33/WRKY12-RAP2.2分子功能模塊參與擬南芥水淹脅迫的工作模型
綜上所述，該研究表明 WRKY33/WRKY12- RAP2.2 形成級聯(lián)調(diào)控模塊，協(xié)同調(diào)控植物對缺氧脅迫的反應(yīng)。這些結(jié)果豐富了低氧信號調(diào)控通路，并為 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥低氧反應(yīng)中的作用提供了新的認(rèn)識。模式植物擬南芥耐低氧耐澇機(jī)制的解析也為其他作物育種及沿河沿海等地濕地植物的遺傳改良提供了很好的參考，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)保護(hù)都具有重要意義。
四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生 唐湖 為本論文第一作者， 劉喚喚 副研究員為通訊聯(lián)系人，博士研究生 畢浩 、 劉豹 等參與了實(shí)驗(yàn)工作； 劉建全 教授 參與指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文寫作。
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