趙云教授課題組聯(lián)合上海交大樊春海院士課題組構(gòu)建植物基因工程新型核酸報告系統(tǒng)
近日，四川大學趙云教授研究團隊聯(lián)合上海交通大學樊春海院士團隊在Nature Communications在線發(fā)表了題為A protein-independent fluorescent RNA aptamer reporter system for plant genetic engineering的論文。該論文將納米技術(shù)與生物技術(shù)有機結(jié)合，利用核酸納米技術(shù)首次構(gòu)建了植物RNA水平上的遺傳轉(zhuǎn)化報告系統(tǒng)，并在擬南芥和煙草的遺傳轉(zhuǎn)化中得到了驗證。
植物基因工程是植物遺傳改良的重要工具，其中報告系統(tǒng)是進行靶基因操作和轉(zhuǎn)基因篩選的燈塔。現(xiàn)有的報告系統(tǒng)均是建立在蛋白質(zhì)水平上，如熒光蛋白（FPs）、β-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）和熒光素酶（Luc）。然而蛋白報告系統(tǒng)在應(yīng)用中存在一些限制，如外源蛋白大量積累對植物生長發(fā)育和生理活動的負面影響，T-DNA的不完全插入導致報告基因無法真實反映靶基因的表達水平，蛋白質(zhì)報告系統(tǒng)無法應(yīng)用于非編碼RNA的研究等。RNA核酸適配體作為RNA動態(tài)成像的重要工具，已成功應(yīng)用于動物細胞中瞬時表達靶RNA的標記成像，但在植物中還沒有報道。如果能將RNA核酸適配體在植物細胞中成像，并進一步用于標記靶基因的mRNA，則可以避免蛋白報告系統(tǒng)在應(yīng)用中的一些缺陷，在植物基因工程中將體現(xiàn)巨大的優(yōu)勢。
圖1 3WJ-nBro核酸適配體活體成像
該研究以當前RNA核酸適配體的最新進展為基礎(chǔ)，設(shè)計構(gòu)建了一系列新型RNA核酸適配體3WJ-nBro。3WJ-nBro與已有應(yīng)用的核酸適配體F30-Broccoli相比，熒光強度和穩(wěn)定性均有極顯著提高。將3WJ-nBro插入靶基因的終止密碼子之后，通過體外、原核細胞和植物細胞表達，根據(jù)3WJ-nBro標記的mRNA光學特征和穩(wěn)定性，成功篩選鑒定出可用于植物細胞熒光成像的RNA適配體3WJ-4×Bro。體外實驗顯示3WJ-4×Bro標記不同長度的mRNA對其光學特征沒有顯著影響。接下來，研究人員分別在原核細胞和植物細胞中瞬時表達帶有3WJ-4×Bro標記的不同融合mRNA（AtCLE-3WJ-4×Bro，mCherry-3WJ-4×Bro和NtTubα-3WJ-4×Bro），通過共聚焦熒光成像和熒光量化分析發(fā)現(xiàn)3WJ-4×Bro標記可以穩(wěn)定報告原核細胞和植物細胞內(nèi)不同靶mRNA表達；采用DFHBI-1T凝膠染色結(jié)合RNA-Seq，證明細胞內(nèi)熒光來源于完整的融合mRNA，表明3WJ-4×Bro可以準確報告mRNA的表達和位置。此外，該研究采用延時熒光成像、雙熒光共定位和免疫印跡分析等實驗證明3WJ-4×Bro在報告mRNA的同時不影響mRNA的正常生物學功能，如出核轉(zhuǎn)運和翻譯過程。
圖2 3WJ-4×Bro報告不同mRNA在原核細胞中的表達
進一步，該工作研究了3WJ-4×Bro在植物轉(zhuǎn)化中的實際應(yīng)用。通過比較穩(wěn)定表達GFP和3WJ-4×Bro標記的NtTubα的轉(zhuǎn)基因擬南芥熒光強度，發(fā)現(xiàn)3WJ-4×Bro系統(tǒng)與GFP系統(tǒng)具有相同的報告能力，且3WJ-4×Bro可用于報告不同組織中靶基因mRNA的表達；分析了來自6個NtTubα-3WJ-4×Bro轉(zhuǎn)基因擬南芥T1代家系共766株T2代植株，表明3WJ-4×Bro與靶基因共分離且共表達并遵循孟德爾遺傳定律穩(wěn)定遺傳至后代，3WJ-4×Bro是一個可靠的RNA水平上的植物遺傳報告系統(tǒng)。值得一提的是，該研究利用3WJ-4×Bro報告系統(tǒng)成功實現(xiàn)了對煙草病毒介導的RNA傳遞的可視化示蹤，為RNA在植物細胞間的轉(zhuǎn)移示蹤研究提供了新的工具。
圖3 基于3WJ-4×Bro系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因鑒定和基因表達分析
該研究通過核酸納米技術(shù)首次構(gòu)建RNA水平的植物基因工程報告系統(tǒng)，是納米科學和生命科學交叉的重要成果，突破了蛋白報告系統(tǒng)的應(yīng)用限制，同時也為植物RNA定位、行為及功能研究提供可視化的新工具，對于植物基因工程的發(fā)展和應(yīng)用具有重要意義。
博士研究生白九元、羅耀和王鑫為該論文的共同第一作者，趙云教授、樊春海院士和王睿副研究員為通訊作者。該研究得到中央高?；A(chǔ)研究經(jīng)費和國家重點研發(fā)項目的資助。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-020-17497-7
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