Genome Biology | 魏文勝課題組報(bào)道CRISPR混合文庫篩選新方法
2019年1月25日，魏文勝課題組在Genome Biology雜志在線發(fā)表了題為“Guide RNAs with embedded barcodes boost CRISPR-pooled screens”的研究論文。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為強(qiáng)大的基因組編輯工具被廣泛運(yùn)用于基因的功能性篩選研究。魏文勝課題組在2014至 2018年先后實(shí)現(xiàn)了針對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因和長(zhǎng)鏈非編碼RNA的高通量功能性篩選（Zhou et al. Nature 2014; Zhu et al. Nature Biotechnology 2016; Liu et al. Nature Biotechnology 2018）。為保證篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要避免混合型文庫中的“搭車效應(yīng)”。目前通行的方法要求在慢病毒侵染構(gòu)建文庫時(shí)保證較低的感染復(fù)數(shù)（MOI）；同時(shí)為獲得高度可重復(fù)性的結(jié)果，需要多組實(shí)驗(yàn)重復(fù)。這些要求使常規(guī)篩選工作量巨大；同時(shí)當(dāng)細(xì)胞來源受限時(shí)（如原代細(xì)胞），難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的功能性篩選研究。
為解決以上難題，魏文勝課題組建立了允許高感染復(fù)數(shù)構(gòu)建CRISPR文庫的新方法。重新設(shè)計(jì)的sgRNA被賦予多條分子條碼，被命名為iBAR （internal barcode）（圖1）。這些內(nèi)置分子條碼能夠多次、獨(dú)立追蹤sgRNA富集程度，結(jié)合重新適配的MAGeCKiBAR的生物信息學(xué)分析方法，成功避免了在高感染復(fù)數(shù)條件下的“搭車效應(yīng)”，并提高了數(shù)據(jù)可靠性。與常規(guī)篩選比較，iBAR方法提高了功能性篩選的敏感性，顯著降低由于高感染復(fù)數(shù)建庫篩選中產(chǎn)生的高假陽性和假陰性。該研究成果首次實(shí)現(xiàn)了在高M(jìn)OI條件下的高通量功能性篩選，顯著降低了工作量，提高了篩選準(zhǔn)確性，為在原代細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)篩選提供了重要工具。
圖1：CRISPR iBAR文庫篩選分析流程示意圖
魏文勝課題組的國(guó)家博新計(jì)劃博士后朱詩優(yōu)、博士生曹中正（CLS 15級(jí)）、劉志恒（CLS 15級(jí)）以及何苑（生命學(xué)院16級(jí)）為該論文共同第一作者。該研究項(xiàng)目得到了國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心以及傳染病防治國(guó)家科技重大專項(xiàng)的基金支持。
文章鏈接：https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-019-1628-0
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