Cancer Cell | 湯富酬課題組與付衛(wèi)課題組合作揭示結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境細胞的遺傳變異
腫瘤微環(huán)境是由腫瘤組織中的各種非上皮細胞以及胞外基質(zhì)共同組成的，其中非上皮細胞主要包括腫瘤浸潤的各種免疫細胞、成纖維細胞以及血管內(nèi)皮細胞等，而腫瘤浸潤的免疫細胞又包括T細胞、B細胞、NK細胞和巨噬細胞等。這些細胞通過與癌上皮細胞之間復雜的相互作用影響了腫瘤的發(fā)生和進展。近年來單細胞轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用到腫瘤微環(huán)境研究中，但是這些微環(huán)境細胞究竟被癌細胞馴化到何種程度，特別是腫瘤微環(huán)境細胞是否發(fā)生了遺傳改變等問題仍然沒有得到深入研究。
近年來，多項研究證實了人類正常組織的上皮細胞中普遍存在基因突變，并且“正常”組織上皮細胞中突變的大量積累被認為是一種潛在的癌前病變機制[1]。然而對于大片段的基因組拷貝數(shù)變異（somatic copy number alterations, SCNAs）的研究仍然主要依賴大量細胞混合樣品的基因組測序（bulk sequencing），這種方式只能檢測到頻率較高（>5%）的克隆性拷貝數(shù)變異，容易忽視潛在的低頻率、非克隆性的基因組拷貝數(shù)變異，有可能極大地低估了基因組拷貝數(shù)變異在人類“正常”組織中的普遍性[2, 3]。
2020年10月22日，北京大學生命科學學院、北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）湯富酬課題組與北京大學第三醫(yī)院普通外科付衛(wèi)課題組合作在國際知名學術(shù)期刊Cancer Cell上發(fā)表題為“Single-cell Multiomics Sequencing Reveals Prevalent Genomic Alterations in Tumor Stromal Cells of Human Colorectal Cancer”的研究論文。該研究從21例微衛(wèi)星穩(wěn)定的結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除標本中獲取了癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織、癌旁組織以及外周血樣品，同時從6例非癌癥個體中獲取了外周血樣品，對多種非上皮細胞進行了高精度的單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組雙組學測序。該研究首先建立并優(yōu)化了一項單細胞基因組和轉(zhuǎn)錄組雙組學測序技術(shù)，通過對單個細胞的細胞核和細胞質(zhì)進行分離，使得對同一個單細胞能夠同時進行轉(zhuǎn)錄組和基因組測序。并在此基礎上系統(tǒng)地研究了腫瘤微環(huán)境以及正常組織中免疫細胞、成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞中基因組拷貝數(shù)變異的發(fā)生頻率和特征，揭示了腫瘤微環(huán)境中發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的成纖維細胞存在特異性克隆擴張現(xiàn)象；同時，通過單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了5個腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞特異性表達的腫瘤標志物，均與結(jié)直腸癌預后密切相關(guān)（圖1，2）。
圖1. 研究的主要發(fā)現(xiàn)概述
圖2. 取樣、測序和分析的方案設計
該研究有3個主要發(fā)現(xiàn)：
（1）以基因組拷貝數(shù)變異為代表的遺傳變異在人體正常組織的各種免疫細胞、成纖維細胞以及血管內(nèi)皮細胞中廣泛存在。
在該研究中，研究人員利用單細胞雙組學測序技術(shù)對來自21例結(jié)直腸癌患者以及6例未患癌癥的正常人的總計15,312個單細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了深入分析。根據(jù)細胞類型特異性表達的標記基因，這些細胞被分為8個主要細胞類群，包括上皮細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、T細胞、NK細胞、B細胞、肥大細胞以及其他髓系免疫細胞。令人驚訝的是，即使在非癌的正常組織中，所有細胞類群中都發(fā)現(xiàn)有1%-15%的細胞存在>10 Mb的基因組拷貝數(shù)變異。這說明很可能所有人類個體體內(nèi)的主要細胞類型都存在百分之幾的細胞已經(jīng)發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異等遺傳異常，遺傳異常不是局限于人體內(nèi)上皮細胞中的特殊現(xiàn)象，而是所有主要細胞類型中都存在的普遍現(xiàn)象。這些發(fā)生了永久的、不可逆的遺傳異常的人體細胞有可能參與了人類多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。
通過單細胞基因組數(shù)據(jù)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)不僅在腫瘤浸潤免疫細胞中存在發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的遺傳異常的免疫細胞（1.3%-11.2%），癌旁“正常”組織浸潤的免疫細胞（0.9%-9.7%）、結(jié)直腸癌患者的外周血（1.1%-11.5%）以及未患癌癥的個體的外周血（2.9%-10.2%）中都存在較高比例的遺傳異常的免疫細胞。研究人員一共從8,982個通過嚴格基因組數(shù)據(jù)質(zhì)控的免疫細胞中鑒定出538個（6.0%）發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的細胞?？截悢?shù)變異在每一位結(jié)直腸癌患者（3.0%-11.2%）和每一位未患癌癥的正常人（2.9%-10.2%）的免疫細胞中都普遍存在。通過研究發(fā)生拷貝數(shù)變異的染色體的分布，研究人員發(fā)現(xiàn)在女性個體中，整條X染色體的丟失發(fā)生頻率最高（單個細胞中兩條X染色體缺失一條，從XX變?yōu)閄O），在男性個體中整條Y染色體的丟失發(fā)生頻率最高（從XY變?yōu)閄O），而常染色體的拷貝數(shù)變異似乎是隨機分布的（圖3）。有基因組拷貝數(shù)變異的血管內(nèi)皮細胞在癌旁組織（0.0%-1.4%）、結(jié)腸腸系膜血管內(nèi)皮（3.7%-14.9%）和癌組織（3.9%-12.8%）中也都普遍存在。
圖3. 有基因組拷貝數(shù)變異的免疫細胞在不同個體中普遍存在
（2）腫瘤組織中發(fā)生遺傳異常的成纖維細胞的比例遠遠高于癌旁正常組織，并且遺傳異常的成纖維細胞在腫瘤組織中發(fā)生了顯著的克隆擴張。
研究人員從來自7例結(jié)直腸癌患者癌旁組織的664個成纖維細胞中僅發(fā)現(xiàn)37個細胞發(fā)生了基因組拷貝數(shù)變異，不同患者癌旁組織里成纖維細胞中遺傳異常細胞的比例為1.1%-10.6%，而在來自9例結(jié)直腸癌患者癌組織的1,183個成纖維細胞中發(fā)現(xiàn)了333個發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的細胞，不同患者腫瘤組織成纖維細胞中遺傳異常細胞的比例為11.1%-47.7%，相比于癌旁 “正常”組織比例增加了4倍左右（圖4）。而且癌旁組織中成纖維細胞的基因組拷貝數(shù)變異呈現(xiàn)相對隨機的分布特征，而腫瘤組織成纖維細胞中顯著富集7號染色體拷貝數(shù)增加的細胞。在88個來自腫瘤組織發(fā)生7號染色體拷貝數(shù)變異的成纖維細胞中，有85個細胞存在整條7號染色體拷貝數(shù)增加，并且這85個細胞中位于7號染色體上的基因的平均表達水平要顯著高于（增加了26%）沒有基因組拷貝數(shù)變異的成纖維細胞。7號染色體拷貝數(shù)增加的特異性富集提示了腫瘤微環(huán)境中發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的遺傳異常的成纖維細胞的克隆擴張（圖5）。這說明腫瘤微環(huán)境細胞不是簡單地接受癌上皮細胞的“誘導”而被動地參與腫瘤發(fā)生過程，而是已經(jīng)發(fā)生不可逆的、永久的遺傳變異，因而很可能主動地促進了癌上皮的腫瘤發(fā)生過程。遺傳變異不是像原來普遍認為的那樣只發(fā)生在腫瘤上皮細胞中，而是也廣泛發(fā)生在非上皮的腫瘤微環(huán)境細胞中。
圖4. 發(fā)生基因組拷貝數(shù)變異的成纖維細胞在腫瘤組織中的比例遠遠高于在癌旁“正常”組織中的比例
圖5. 腫瘤組織中的成纖維細胞顯著富集7號染色體拷貝數(shù)增加的細胞
（3）發(fā)現(xiàn)了5個腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞特異表達的腫瘤標志基因，它們的表達水平均與結(jié)直腸癌預后密切相關(guān)。
研究人員鑒定出腫瘤組織中成纖維細胞相對于癌旁組織中成纖維細胞差異表達的76個基因，包括59個上調(diào)基因和17個下調(diào)基因。其中BGN、RCN3、TAGLN、MYL9和TPM2在腫瘤組織成纖維細胞中明顯上調(diào)，經(jīng)TCGA數(shù)據(jù)庫驗證，其高表達與結(jié)直腸癌預后差明確相關(guān)。免疫組化實驗進一步驗證了這5個基因在結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境成纖維細胞中特異性高表達，確定了這5個基因是腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞特異性表達的腫瘤標志基因（圖6）。這一發(fā)現(xiàn)拓展了腫瘤標志基因的種類，從原來主要聚焦于癌上皮細胞表達的標志基因變成同時關(guān)注腫瘤微環(huán)境細胞中特異性表達的腫瘤標志基因。而且腫瘤微環(huán)境細胞特異性表達的腫瘤標志基因更有可能具有跨不同癌種的普適性，其臨床應用場景可能更廣泛。
圖6. 與結(jié)直腸癌預后密切關(guān)聯(lián)的成纖維細胞特異性表達的腫瘤標志基因
綜上所述，本項研究利用高精度單細胞多組學測序技術(shù)，深入系統(tǒng)地分析了27個人類個體的多種非上皮細胞的基因組拷貝數(shù)變異情況，揭示了基因組拷貝數(shù)變異普遍存在于人體成纖維細胞、免疫細胞和血管內(nèi)皮細胞中，并發(fā)現(xiàn)了結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中的成纖維細胞中發(fā)生基因組拷貝數(shù)異常細胞的比例大幅度增加，而且這類遺傳異常的成纖維細胞在腫瘤組織中存在克隆擴張現(xiàn)象。此項研究突破了人們對人體“正常”組織中細胞遺傳變異的認知，充分證明了以基因組拷貝數(shù)變異為代表的遺傳變異在人群中普遍存在，在人體主要細胞類型中普遍存在，提示基因組拷貝數(shù)變異在人類疾病和衰老中可能存在重要作用，并對腫瘤微環(huán)境和腫瘤治療研究提供了新的線索。
北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）博士生周圓、卞舒惠博士（現(xiàn)為生殖醫(yī)學國家重點實驗室PI）、博士生崔月利以及北京大學第三醫(yī)院普通外科周鑫主治醫(yī)師為該論文的并列第一作者。北京大學未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心湯富酬教授和北京大學第三醫(yī)院普通外科付衛(wèi)教授為該論文的共同通訊作者。該研究項目得到了國家自然科學基金和北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心（ICG）的支持。
原文鏈接：https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(20)30489-X
參考文獻：
1. Yizhak, K. et al. RNA sequence analysis reveals macroscopic somatic clonal expansion across normal tissues. Science 364, aaw0726, (2019).
2. Jacobs, K. B. et al. Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer. Nat Genet 44, 651-658, (2012).
3. Laurie, C. C. et al. Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. Nat Genet 44, 642-650, (2012).
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