2018年11月5日，北京大學生命科學學院魏文勝課題組在Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了題為“Genome-wide screening for functional long noncoding RNAs in human cells by Cas9 targeting of splice sites”的研究論文。
作為強大的基因編輯工具，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在蛋白編碼基因的外顯子區(qū)域產(chǎn)生移碼突變而徹底破壞蛋白表達及功能，這一特性被廣泛應用于基因的大規(guī)模功能性篩選研究。人類基因組中除了蛋白編碼基因，絕大多數(shù)區(qū)域為非編碼序列。其中長鏈非編碼RNA（lncRNA）已有上萬個位點被注釋，但是它們絕大多數(shù)功能未知，一些已知功能的lncRNA與癌癥等很多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
魏文勝課題組與合作者之前率先建立了通過成對gRNA（pgRNA）在基因組中產(chǎn)生大片段刪除的策略來對lncRNA進行高通量功能性篩選（Zhu et al. Nature Biotechnol 2016）。后續(xù)又有報道通過CRISPRi（Liu et al. Science 2017）以及CRISPRa（Joung et al. Nature 2017）等方法來進行l(wèi)ncRNA的高通量功能性篩選。這些方法在效率、質(zhì)量（假陽性、假陰性）上各有欠缺：比如CRISPRi的方法只能實現(xiàn)基因表達抑制而不是完全敲除，CRISPRa的方法只能上調(diào)基因表達，無法對基因不可或缺的作用實施篩選評估。大片段刪除的策略由于步驟的繁瑣，也限制了其在更大規(guī)模上得到應用。
為了突破以上方法上的局限，魏文勝研究組設(shè)計了新的篩選策略，構(gòu)建了特異性靶向基因的剪接位點的新型CRISPR文庫，以高通量的方式產(chǎn)生基因的外顯子缺失或者內(nèi)含子滯留。運用這一策略，實現(xiàn)了全基因組水平上對于lncRNA功能的高效篩選。利用靶向10,996個 lncRNA的特殊CRISPR文庫，在慢性髓性白血病細胞K562中篩選并發(fā)現(xiàn)了230個 lncRNA與細胞存活或增殖相關(guān)。在HeLa細胞以及人B淋巴細胞GM12878中則分別發(fā)現(xiàn)了115個及220個影響細胞存活與增殖的lncRNA。進一步分析表明，lncRNA功能在不同細胞種類中具有顯著異質(zhì)性。這一新型高通量技術(shù)平臺的建立，首次真正實現(xiàn)了從全基因組水平對長鏈非編碼RNA進行基于完全敲除的高通量篩選，該方法學將為系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和解析lncRNA功能提供有效的工具。
(a) 真核生物（人）剪接位點區(qū)域的基因組序列特征和堿基特異性。(b) 靶向剪接位點的長非編碼RNA的功能性篩選策略。(c) K562細胞中影響細胞存活與增殖的lncRNA篩選結(jié)果。
該研究于11月5日在線發(fā)表于Nature Biotechnology（DOI: 10.1038/nbt.4283）。魏文勝課題組的博士生劉瑩（CLS 14級）、曹中正（CLS 15級）、王軼楠博士（CLS 13級）以及博士后郭昱博士為該論文共同第一作者。該研究項目得到了國家自然科學基金重點項目、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心和北大-清華生命科學聯(lián)合中心的基金支持。
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