Cell Stem Cell | 湯富酬課題組與合作者建立人類精子發(fā)生過程高精度轉(zhuǎn)錄組圖譜
人類精子發(fā)生過程承載著將父源基因組遺傳信息進(jìn)行精準(zhǔn)代際傳遞的任務(wù)，也是人類自身繁育和物種延續(xù)的重要保障。全世界約有10-15%的育齡夫婦存在不孕不育的問題，其中，男性因素約占50%左右。闡明人類精子發(fā)生過程中的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制是發(fā)育生物學(xué)的重大科學(xué)問題，對(duì)理解、診斷和治療男性不育相關(guān)疾病至關(guān)重要。
2018年8月30日，北京大學(xué)北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學(xué)學(xué)院BIOPIC中心湯富酬課題組，北京大學(xué)第三醫(yī)院?jiǎn)探苷n題組和南方醫(yī)科大學(xué)趙小陽課題組，聯(lián)合在國際知名學(xué)術(shù)期刊《Cell Stem Cell》上在線發(fā)表了題為“Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis”的研究論文。首次從單細(xì)胞水平系統(tǒng)闡明了人類精子發(fā)生過程中的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變路徑，繪制了人類精子發(fā)生的高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，解析了成年男性全部生殖細(xì)胞類型及其關(guān)鍵的分子標(biāo)記，并初步探索了將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)用于人類非梗阻性無精癥的研究和診斷。
研究團(tuán)隊(duì)首先分離并獲取了正常成年男性和梗阻性無精癥患者的2,854個(gè)睪丸組織細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行了高精度的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，并結(jié)合t-SNE、PCA和Monocle2等多種生物信息學(xué)分析方法對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘，在國際上首次完成了人類精子發(fā)生過程中的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變和基因表達(dá)圖譜的繪制。在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)一例非梗阻性無精癥患者的174個(gè)睪丸細(xì)胞進(jìn)行研究，確定了該無精癥患者睪丸中的各種細(xì)胞類型及其與正常人睪丸中對(duì)應(yīng)的細(xì)胞類型相比發(fā)生的基因表達(dá)異常，為男性不育的臨床診斷提供了新的思路。
1. 人類精子發(fā)生過程中的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變和基因表達(dá)動(dòng)態(tài)
該研究選取臨床捐獻(xiàn)的成年男性睪丸組織為材料，通過隨機(jī)挑選或流式分選兩種策略獲取睪丸組織的單細(xì)胞樣品，隨后進(jìn)行高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并借助計(jì)算生物學(xué)方法對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘（圖1a）。經(jīng)過非監(jiān)督聚類分析，發(fā)現(xiàn)在2,854個(gè)睪丸細(xì)胞中共存在17種不同的細(xì)胞類型，其中14種為各個(gè)分化階段的睪丸生殖細(xì)胞，另外3種為睪丸微環(huán)境體細(xì)胞（圖1b）。利用眾多特異的標(biāo)志基因?qū)λ屑?xì)胞類型進(jìn)行身份鑒定，最終確定出3種精原細(xì)胞，包括精原干細(xì)胞（SSC）、分化中的精原細(xì)胞（Diff.ing SPG）、分化后的精原細(xì)胞（Diff.ed SPG）；7種精母細(xì)胞，包括3種細(xì)線期精母細(xì)胞（L1~L3）、偶線期精母細(xì)胞（Z）、粗線期精母細(xì)胞（P）、雙線期精母細(xì)胞（D）、分裂期初級(jí)精母細(xì)胞及次級(jí)精母細(xì)胞（SPC7）；以及4種精子細(xì)胞（S1~S4）（圖1c）。通過Monocle2對(duì)人類精子發(fā)生過程進(jìn)行擬時(shí)間發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)由以上14種生殖細(xì)胞構(gòu)成的發(fā)育路徑與經(jīng)典的生精上皮發(fā)育過程高度吻合（圖1d）。至此，該研究首次借助高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)完整地描繪了人類精子發(fā)生過程中細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的精確過程和基因表達(dá)變化的動(dòng)態(tài)圖譜，為進(jìn)一步深度解析人類精子的發(fā)生過程奠定了重要的研究基礎(chǔ)。
圖1：人類精子發(fā)生的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜（a）研究流程示意圖；（b）17類睪丸細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的t-SNE分析圖；（c）人類生精過程中標(biāo)志基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化圖；（d）人類睪丸生殖細(xì)胞的擬時(shí)間發(fā)育圖
2. 人類精原細(xì)胞的自我更新、分化及參與的信號(hào)通路
基于t-SNE分析，該研究發(fā)現(xiàn)了3種人類精原細(xì)胞類型，通過分析細(xì)胞類型特異的標(biāo)志基因在3種精原細(xì)胞類型中的表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)精原干細(xì)胞高度富集了與自我更新調(diào)控相關(guān)的GFRA1、RET以及與干性維持相關(guān)的SALL4、UTF1等關(guān)鍵基因；而進(jìn)入到下一個(gè)發(fā)育階段（分化中的精原細(xì)胞），DMRT1、KIT等與精原分化相關(guān)的基因開始富集；最終在分化后的精原細(xì)胞中，減數(shù)分裂啟動(dòng)的標(biāo)志分子STRA8開始高表達(dá)，標(biāo)志著人類精原細(xì)胞正式啟動(dòng)減數(shù)分裂（圖2a）。除了經(jīng)典的RET信號(hào)通路，該研究發(fā)現(xiàn)并且驗(yàn)證了BMPR1B與FGFR3為人類精原干細(xì)胞特異性表達(dá)的標(biāo)志分子，也首次在精原干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)BMP與FGF信號(hào)通路從配體、受體到效應(yīng)分子均呈現(xiàn)高度富集的特點(diǎn)（圖2b，2c），這一結(jié)果表明，BMP和FGF信號(hào)通路很可能在人類精原干細(xì)胞的自我更新過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
圖2：精原細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控（a）精原細(xì)胞階段特異標(biāo)志基因的表達(dá)熱圖；（b）睪丸組織BMPR1B、FGFR3的RNA原位雜交與DDX4的免疫熒光染色定位；（c）BMP、FGF信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)熱圖
3. 人類精母細(xì)胞的基因表達(dá)特征
精原細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂并發(fā)育為各級(jí)精母細(xì)胞，在細(xì)線期與偶線期，同源重組相關(guān)基因DMC1、SPO11與聯(lián)會(huì)復(fù)合體組分SYCP1、SYCP3、SYCE1等高度富集（圖3a），表明該階段正在高度有序地發(fā)生同源重組與同源染色體聯(lián)會(huì)等重要的生物學(xué)事件，以確保減數(shù)分裂的正確發(fā)生。隨著粗線期（P）同源染色體配對(duì)與聯(lián)會(huì)的完成，聯(lián)會(huì)復(fù)合體逐漸在雙線期（D）開始解體，隨后初級(jí)精母細(xì)胞進(jìn)入分裂期，進(jìn)而一分為二產(chǎn)生2個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞（SPC7）。由于分裂期初級(jí)精母細(xì)胞與次級(jí)精母細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程非常短暫，其基因表達(dá)特征鮮有報(bào)道。在該研究中，通過對(duì)各級(jí)精母細(xì)胞的基因表達(dá)特征進(jìn)行精細(xì)分析，并結(jié)合CCNA1/2、頂體素酶原（ACR）、γH2AX、DDX4等的表達(dá)特征（圖3a，3b），首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)人類分裂期初級(jí)精母細(xì)胞與次級(jí)精母細(xì)胞的身份確認(rèn)，并確定了其整體水平上的基因表達(dá)特征。
圖3：精母細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控（a）精母細(xì)胞階段特異標(biāo)志基因的表達(dá)熱圖；（b）ACR、TJP3的表達(dá)圖；（c）CCNA1/2、PNA、γH2AX和DDX4在SPC7中的表達(dá)特征
4. 人類精子細(xì)胞的發(fā)育及其調(diào)控機(jī)制
1個(gè)四倍體的初級(jí)精母細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生2個(gè)二倍體的次級(jí)精母細(xì)胞，并最終產(chǎn)生4個(gè)單倍體的精子細(xì)胞。隨后，精子細(xì)胞需要經(jīng)過魚精蛋白轉(zhuǎn)換、細(xì)胞質(zhì)脫落、鞭毛生成等一系列的重要生物學(xué)變化，最終成為可游動(dòng)的成熟精子。在整體轉(zhuǎn)錄水平上，精子細(xì)胞從第一個(gè)階段（S1）到第四個(gè)階段（S4）呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本總量逐漸下降的趨勢(shì)，這表明精子成熟過程伴隨著基因表達(dá)整體水平的降低。該研究發(fā)現(xiàn)精子細(xì)胞階段表達(dá)的基因可細(xì)分為4個(gè)類別，包括2類轉(zhuǎn)錄下調(diào)的基因，1類轉(zhuǎn)錄先上調(diào)而后下調(diào)的基因，以及1類表達(dá)上調(diào)的基因（圖4a）。對(duì)這4類基因的深入研究將有助于我們了解人類精子成熟的調(diào)控機(jī)制。
通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)人類精子細(xì)胞可分為四種類型（S1~S4）。進(jìn)一步通過DDX4、TNP1、PRM1、PNA等標(biāo)志分子的蛋白表達(dá)特征，證實(shí)人類睪丸中存在上述四種精子細(xì)胞類型（圖4b，4c）。
圖4：精子成熟過程的基因表達(dá)調(diào)控（a）與人類精子細(xì)胞成熟相關(guān)的4類基因；（b）精子細(xì)胞階段特異標(biāo)志基因的表達(dá)熱圖；（c）DDX4、TNP1、PRM1、PNA在人類精子細(xì)胞中的表達(dá)特征
5. 人類睪丸的體細(xì)胞微環(huán)境
t-SNE分析發(fā)現(xiàn)人類睪丸中的體細(xì)胞主要分為三大類：支持細(xì)胞（ST）、MIX細(xì)胞、以及睪丸巨噬細(xì)胞（tMφ）。支持細(xì)胞中高度富集視黃酸合成相關(guān)基因（ALDH1A1），視黃酸通過旁分泌途徑誘導(dǎo)精原細(xì)胞表達(dá)STRA8，使其進(jìn)入減數(shù)分裂（圖5a）。而MIX細(xì)胞在基因表達(dá)水平上存在較大的異質(zhì)性，通過t-SNE對(duì)MIX進(jìn)行重新分群，發(fā)現(xiàn)MIX包含表達(dá)INSL3、DLK1的間質(zhì)細(xì)胞和表達(dá)MYH11、ACTA2的管周肌樣細(xì)胞（圖5b）。免疫熒光定位檢測(cè)證實(shí)了人類睪丸組織中的體細(xì)胞微環(huán)境主要由支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞和睪丸巨噬細(xì)胞共同形成（圖5c）。人類睪丸體細(xì)胞主要參與性激素合成、減數(shù)分裂的啟動(dòng)、細(xì)胞間的粘附與遷移，以及睪丸內(nèi)的免疫反應(yīng)，尤其是睪丸巨噬細(xì)胞，這類很少被關(guān)注到的細(xì)胞類型將為探索人類睪丸微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持提供新的研究思路。
圖5：睪丸體細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控（a）人類睪丸體細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)熱圖；（b）利用t-SNE對(duì)MIX進(jìn)行重新分群，以及兩個(gè)亞群中INSL3、DLK1、 MYH11和ACTA2的表達(dá)特征；（c）免疫熒光染色證實(shí)人類睪丸中存在4類體細(xì)胞
6. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組用于確定非梗阻性無精癥患者的睪丸細(xì)胞類型和基因表達(dá)特征
人類睪丸的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜的繪制，使研究者對(duì)非梗阻性無精癥的深入研究成為可能。通過對(duì)一例非梗阻性無精癥患者的174個(gè)睪丸細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞主要聚類到睪丸體細(xì)胞類型中的支持細(xì)胞和MIX細(xì)胞，對(duì)該例非梗阻性無精癥患者的體細(xì)胞差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了包括BEX1、FATE1在內(nèi)的一系列可能與該疾病發(fā)生相關(guān)的差異基因（圖6b，6c）。利用Gene Ontology（GO）對(duì)差異基因進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，非梗阻性無精癥患者的體細(xì)胞中高度富集細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程（圖6d）。隨后，免疫熒光染色結(jié)果證實(shí)了該例非梗阻性無精癥患者睪丸組織中細(xì)胞凋亡表征明顯。通過對(duì)該例無精癥的探索，建立了基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的無精癥分子診斷平臺(tái)，為研究不育癥致病機(jī)制和臨床診斷提供了新的思路。
圖6：無精癥睪丸細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控（a）生精上皮完整男性的2,854個(gè)睪丸細(xì)胞及NOA患者的174個(gè)睪丸細(xì)胞組成的t-SNE圖；（b）NOA患者與生精上皮完整男性支持細(xì)胞的差異基因火山圖；（c）NOA患者與生精上皮完整男性MIX細(xì)胞的差異基因火山圖；（d）NOA患者的睪丸體細(xì)胞上調(diào)基因中富集的生物學(xué)過程
綜上，該研究在國際上首次成功繪制了人類精子發(fā)生的高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，為人類精子發(fā)生、減數(shù)分裂調(diào)控機(jī)制的研究、無精癥的分子診斷和臨床治療提供了全新的視角。
北京大學(xué)博士生柳溪溪、陳依東，南方醫(yī)科大學(xué)汪妹博士，深圳大學(xué)常港博士，以及廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院安庚博士為該論文的并列第一作者，北京大學(xué)湯富酬教授、喬杰教授、和南方醫(yī)科大學(xué)趙小陽教授為該論文的共同通訊作者。此項(xiàng)工作得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、廣東省科技計(jì)劃、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、以及中國博士后基金的支持。
原文鏈接：https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(18)30392-8
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