顧宏周課題組與合作者《Nature Chemistry》報(bào)道利用DNA納米組裝體按尺寸精確分選脂質(zhì)體新策略用于曲率依賴的膜相關(guān)反應(yīng)研究
?在細(xì)胞中，無(wú)論是胞內(nèi)囊泡與細(xì)胞器還是胞外的分泌囊泡，大量膜蛋白可以在具有極高曲率的彎曲膜上?(曲率半徑<50 nm）分布并維持其結(jié)構(gòu)域，為了理解這些膜蛋白與高曲率膜的依存關(guān)系及其功能行為，人們亟需一種模型體系進(jìn)行膜結(jié)構(gòu)的仿生研究，而粒徑大小精確可控的脂質(zhì)體可以提供這樣的理想平臺(tái)（粒徑與曲率成反比）。在現(xiàn)有的脂質(zhì)體制備策略中，粒徑大小的調(diào)控依賴于制備條件、均一化的處理方式及純化方式等，但得到的脂質(zhì)體產(chǎn)物或者均一性不足，或者只具備若干離散的尺寸，無(wú)法形成一條尺度連續(xù)分布的譜系供精確分析研究。
?2021年3月30日，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院顧宏周研究組與耶魯大學(xué)林晨翔研究組合作在Nature Chemistry期刊上發(fā)表了文章“Sorting sub-150-nm liposomes of distinct sizes by DNA-brick-assisted centrifugation”，報(bào)道了一種全新的脂質(zhì)體分選策略。研究者利用DNA納米組裝體比重大、均一度好且易編輯的特性，修飾脂質(zhì)體囊泡使其產(chǎn)生與粒徑大小關(guān)聯(lián)的密度差異，從而在密度梯度介質(zhì)中分離獲得尺寸連續(xù)分布且均一的脂質(zhì)體（圖1），建立了可用于精確定量研究膜蛋白作用的脂質(zhì)體平臺(tái)。
圖1：利用DNA納米組裝體輔助脂質(zhì)體按粒徑大小精確分離的原理
?作者示范了基于“DNA組裝體輔助法”可通過(guò)一次超速離心，分離多個(gè)粒徑連續(xù)分布在30-150 nm內(nèi)且大小高度均一的脂質(zhì)體組分；與其它常規(guī)制備方法相比，新方法不僅實(shí)現(xiàn)了多種尺寸脂質(zhì)體的同時(shí)制備，而且將脂質(zhì)體的大小區(qū)分精度從50-100 nm左右提升到10-18 nm，偏差率從35%-40%降低到9%-14%（圖2）。
圖2：不同方法制備/分離的脂質(zhì)體囊泡的對(duì)比?
?對(duì)于DNA組裝體修飾可能會(huì)影響脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的完整度，作者使用脂質(zhì)體裝載一類核酶（感應(yīng)鋅離子發(fā)生自剪切的DNA序列）進(jìn)行了滲漏性的檢驗(yàn)：將DNA組裝體輔助分選的脂質(zhì)體置于含有鋅離子的溶液中孵育12h，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體內(nèi)的核酶沒(méi)有發(fā)生自剪切，直到加入表面活性劑將膜溶解（圖3）。這一現(xiàn)象直接證明了分選后的脂質(zhì)體既不會(huì)向內(nèi)漏入鋅離子，也不會(huì)向外漏出核酶分子，保持了很好的完整度。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DNA結(jié)構(gòu)包被的脂質(zhì)體可在室溫下保持形態(tài)穩(wěn)定超過(guò)六個(gè)月，在需要裸露出膜表面時(shí)可利用核酸外切酶對(duì)DNA組裝體修飾進(jìn)行降解去除。
圖3：脂質(zhì)體包載內(nèi)容物實(shí)驗(yàn)及完整度檢測(cè)
?隨后，作者基于粒徑大小精確可控的一系列脂質(zhì)體系統(tǒng)性研究了多種膜表面反應(yīng)和膜蛋白作用。ATG3是一種能夠感知膜曲率變化的連接酶，自噬體的生長(zhǎng)成熟伴隨著其膜表面的磷脂經(jīng)ATG3催化后的脂質(zhì)化（GL1）。利用多個(gè)粒徑分布在30-130 nm的脂質(zhì)體組分，作者首次確定了GL1脂質(zhì)化反應(yīng)更易發(fā)生在粒徑為30-55 nm的脂質(zhì)體上，且在40 nm時(shí)反應(yīng)效率最高（圖4）。由此可見(jiàn)，粒徑均一且連續(xù)分布的脂質(zhì)體提高了體外研究脂化反應(yīng)的精度，為定量分析和測(cè)量其它依賴于囊泡粒徑大小的生化作用提供了可靠的研究平臺(tái)。?
圖4：精細(xì)化研究曲率敏感的蛋白脂化反應(yīng)?
?作為調(diào)控細(xì)胞膜融合的一類關(guān)鍵蛋白，v-SNAREs和t-SNAREs通過(guò)特異互作拉近膜之間的相互距離。此前的研究表明，膜曲率可能是決定這一融合過(guò)程發(fā)生的關(guān)鍵性因素，但因缺乏尺度連續(xù)分布的脂質(zhì)體模型，曲率依賴性膜融合的系統(tǒng)性研究始終無(wú)法很好的開(kāi)展。作者證明DNA納米組裝體同樣可輔助Proteoliposome（鑲嵌了跨膜蛋白的脂質(zhì)體）按粒徑大小進(jìn)行精確分離（圖5）。在30-110 nm范圍內(nèi)，依托分離出的一系列大小均一并攜帶了v-SNARE的脂質(zhì)體，作者得以精確地測(cè)量膜曲率對(duì)膜融合的影響，揭示了膜曲率越高則融合速率越快，且粒徑小于60 nm的脂質(zhì)體的融合速率和融合輪次顯著升高的規(guī)律。該工作為更好地模擬細(xì)胞生成的囊泡和系統(tǒng)分析測(cè)量曲率相關(guān)的“膜-膜互作”提供了模板。
圖5：精細(xì)化研究曲率與膜融合反應(yīng)效率之間的關(guān)系
?據(jù)悉，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院林晨翔教授和復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院顧宏周教授為本文的共同通訊作者。楊洋（耶魯大學(xué)/上海交通大學(xué)）、吳振永（耶魯大學(xué)）為本文共同第一作者，夏凱（復(fù)旦大學(xué)/附屬中山醫(yī)院）為本文的數(shù)據(jù)重復(fù)等提供了重要的支持。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41557-021-00667-5
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