顧宏周課題組《Chem》報(bào)道利用DNA核酶開(kāi)發(fā)高效制備單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)的新方法
?近15年來(lái)，作為構(gòu)建DNA納米組裝體的主要方法之一，DNA折紙術(shù)(DNA origami)可使得一條長(zhǎng)單鏈DNA在成百或千條短鏈DNA的輔助下, 通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則折疊并鎖定生成所設(shè)計(jì)的納米圖案，它的出現(xiàn)極大地推動(dòng)了DNA納米技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展。單鏈DNA折紙術(shù)(single-stranded DNA origami)是傳統(tǒng)DNA折紙術(shù)的一種進(jìn)化和衍生，它摒除了對(duì)眾多短序列的需求，通過(guò)高度集成序列信息于一條長(zhǎng)單鏈DNA中, 實(shí)現(xiàn)了單個(gè)DNA序列的自我折疊和組裝體構(gòu)建（類(lèi)似于蛋白質(zhì)由一條長(zhǎng)肽鏈折疊成三維結(jié)構(gòu)）。
?單鏈DNA組裝體（ssDNs）的可編程性和可尋址性均能與傳統(tǒng)的多鏈DNA 組裝體相媲美，此外它們還具有產(chǎn)物單一、純凈度高的先天優(yōu)勢(shì)及可在生物體內(nèi)復(fù)制的潛力。然而，目前對(duì)于200個(gè)堿基以上的DNA序列，化學(xué)合成的成本高、產(chǎn)量低，當(dāng)序列中包含較多的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)會(huì)進(jìn)一步阻礙合成的效率，這些因素限制了單鏈DNA組裝體在生命和材料科學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。
?2021年3月30日，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院顧宏周課題組在Chem雜志上發(fā)表題為“DNA-catalyzed efficient production of single-stranded DNA nanostructures”的工作，報(bào)道了一種高效制備單鏈DNA納米結(jié)構(gòu)的生物方法。作者通過(guò)將多個(gè)單鏈DNA組裝體序列以假基因片段形式與自切割型DNA核酶序列有機(jī)串聯(lián)成一個(gè)整體，并重組到噬菌體基因組中，實(shí)現(xiàn)了依托噬菌體存儲(chǔ)組裝體序列信息，可隨時(shí)擴(kuò)增放大并根據(jù)需求制備相應(yīng)單鏈DNA組裝體的策略。
?作者以一條由520 個(gè)堿基的序列折疊而成的三角形組裝體為例，展示了制備方法的整個(gè)流程（圖1）。首先，通過(guò)電腦程序輔助設(shè)計(jì)出可自組裝成三角形的長(zhǎng)單鏈DNA序列；隨后，把該組裝體序列作為一個(gè)假基因片段進(jìn)行化學(xué)合成，并在片段的兩端各自插入一個(gè)Zn2+依賴(lài)的自切割型DNA核酶（有催化能力的核酸序列）；接著，將該片段重組到質(zhì)?；蚴删Ｖ校ㄟ^(guò)體外或體內(nèi)的滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增方式放大制備單鏈DNA序列；最后，在添加Zn2+的條件下，DNA核酶自發(fā)切割并釋放出單鏈DNA組裝體序列。
圖1利用自切割型DNA核酶制備單鏈DNA組裝體的示意圖和時(shí)間表
?在德國(guó)人Hendrik Dietz教授團(tuán)隊(duì)“Biotechnological mass production of DNA origami”（Nature，2017）文章中利用順式（cis）DNA核酶制備單鏈DNA的基礎(chǔ)上，作者拓展了活性更強(qiáng)的反式（trans）核酶的使用。當(dāng)多種不同形狀（三角形，520 nt；四邊形，680 nt；菱形，2200 nt；方形結(jié)，1700 nt）的單鏈DNA組裝體出現(xiàn)時(shí)有所需的狀況時(shí)（圖2），作者提出以串聯(lián)多個(gè)組裝體和反式核酶序列的方式，既能在重組和放大過(guò)程中節(jié)約時(shí)間和勞動(dòng)力，又能在切割分離目的組裝體時(shí)獲得高效性和可控性。依托基于反式核酶的生物法，作者制備單鏈DNA組裝體時(shí)成本可低至1500 rmb/g，產(chǎn)量可達(dá)g-kg，長(zhǎng)度可至10000個(gè)堿基以上。
圖2利用反式（trans）切割型DNA核酶高效可控地分離制備單鏈DNA組裝體
?綜上，該研究提出了一種利用反式切割型DNA核酶突破化學(xué)合成長(zhǎng)單鏈DNA序列瓶頸的生物法策略，為單鏈DNA組裝體的高效制備奠定了基礎(chǔ)，也為基于DNA組裝體的下游應(yīng)用，如輔助脂質(zhì)體分離制備及研究細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取等掃清了障礙。此外，長(zhǎng)單鏈DNA序列的高效制備還可能為基于長(zhǎng)程單鏈DNA片段的基因敲入、基于長(zhǎng)程鎖式探針的長(zhǎng)程測(cè)序等新技術(shù)的發(fā)展提供支撐。
?據(jù)悉，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院顧宏周研究員（復(fù)旦大學(xué)附屬口腔醫(yī)院雙聘研究員）為本文通訊作者。賈友禮、陳黎曼為本文的共同第一作者。
原文鏈接：https://www.cell.com/chem/fulltext/S2451-9294(20)30633-1
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