Nature Biotechnology | 李毓龍組及其合作者報(bào)道新型乙酰膽堿熒光探針的開發(fā)及其應(yīng)用
2018年7月9日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、PKU-IDG/麥戈文腦科學(xué)研究所李毓龍研究組及其合作者，在《Nature Biotechnology》雜志在線發(fā)表了題為《A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies》的研究論文，首次成功開發(fā)了靈敏、特異、可遺傳編碼的乙酰膽堿熒光探針，并成功地在不同生物體系中實(shí)時(shí)檢測內(nèi)源乙酰膽堿信號，為理解乙酰膽堿在生理和病理?xiàng)l件下的功能提供了重要的工具。
乙酰膽堿是研究史上第一個(gè)被鑒定的神經(jīng)遞質(zhì)，其相關(guān)研究推動了神經(jīng)遞質(zhì)和突觸傳遞的概念的建立1-4。目前人們已經(jīng)對乙酰膽堿能神經(jīng)元在外周神經(jīng)系統(tǒng)（尤其是神經(jīng)肌肉接點(diǎn)）的功能有了較為明確的闡述，但對其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識仍存在較大爭議5。由于乙酰膽堿能神經(jīng)元在皮層等區(qū)域的廣泛投射，傳統(tǒng)研究認(rèn)為乙酰膽堿在大腦中作為廣譜的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，在多個(gè)腦區(qū)起到均一化的作用，如調(diào)節(jié)覺醒等生理功能6、7。然而，隨著近年來神經(jīng)環(huán)路研究的推動，乙酰膽堿能神經(jīng)元參與的神經(jīng)環(huán)路與學(xué)習(xí)記憶、注意、獎賞等行為的相關(guān)性被逐漸解析，并且其功能多呈現(xiàn)區(qū)域特異性甚至神經(jīng)元特異性的功能調(diào)節(jié)8-10。與此相對，在多種復(fù)雜神經(jīng)疾病如成癮、阿茲海默癥中都伴隨著特定腦區(qū)膽堿能信息傳遞的異常11-13。子曰：“工欲善其事，必先利其器”。進(jìn)一步的了解乙酰膽堿的生理功能及其在疾病中的貢獻(xiàn)需要合適的方法，能夠細(xì)胞特異性且實(shí)時(shí)靈敏的對乙酰膽堿在特定行為中的動態(tài)變化進(jìn)行追蹤。
與其從頭設(shè)計(jì)，不如借鑒大自然的鬼斧神工。該研究首次通過對于神經(jīng)遞質(zhì)特異的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）進(jìn)行改造，通過在特定位置嵌入循環(huán)重排的熒光蛋白14，將受體在被神經(jīng)遞質(zhì)激活后的構(gòu)象變化轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒獾鞍谉晒庑盘柕淖兓M(jìn)而反映對應(yīng)神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化。通過對于乙酰膽堿受體的改造以及一系列突變篩選和優(yōu)化，該研究獲得對于乙酰膽堿具有靈敏光學(xué)響應(yīng)的熒光探針，其對于生理濃度乙酰膽堿具有高信噪比的光學(xué)信號變化，并且具有亞秒級的反應(yīng)速度以及良好的分子特異性，可實(shí)現(xiàn)時(shí)空特異的對于乙酰膽堿信號的精確指征。
乙酰膽堿探針在培養(yǎng)細(xì)胞中表現(xiàn)出對乙酰膽堿特異的熒光響應(yīng)
在進(jìn)一步工作中，該研究應(yīng)用新開發(fā)的乙酰膽堿探針，在小鼠的多個(gè)腦區(qū)的急性腦片體系中成功檢測了內(nèi)源的乙酰膽堿釋放，并且闡明了乙酰膽堿釋放如何受到突觸前神經(jīng)元活性的調(diào)節(jié)，以及其在生理情況下的空間作用范圍，為該領(lǐng)域長久以來的爭論提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。同時(shí)，應(yīng)用果蠅和小鼠為模式動物，該研究成功實(shí)現(xiàn)了在活體果蠅的嗅覺系統(tǒng)中檢測內(nèi)源乙酰膽堿對嗅覺信息的編碼，以及在小鼠視覺皮層神經(jīng)元乙酰膽堿在注意性視覺刺激時(shí)的動態(tài)變化。這一系列工作為了解乙酰膽堿在不同生理情況下的釋放及其功能提供了良好的范例。
北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李毓龍研究員與弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院朱駿教授為文章的共同通訊作者。李毓龍組博士研究生井淼、朱駿組張鵬博士為共同一作。北京生命科學(xué)研究所羅敏敏課題組，北京大學(xué)宋艷課題組，弗吉尼亞大學(xué)Paula Barrett課題組，加利福尼亞大學(xué)圣克魯斯分校左毅課題組，南加州大學(xué)張立課題組，石溪大學(xué)Lorna Role課題組、David Talmage課題組為研究提供了重要的支持和幫助。本工作獲得了北京大學(xué)膜生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）、國家自然科學(xué)基金、美國腦計(jì)劃對李毓龍研究組的大力支持。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/nbt.4184
參考文獻(xiàn)：
1. Dale, H.H., Feldberg, W. & Vogt, M. Release of acetylcholine at voluntary motor nerve endings. The Journal of Physiology 86, 353-380 (1936).
2. Loewi, O. Weiteres ber Humorale bertragbarkeit der Herznervenwirkung. Klinische Wochenschrift 3, 680-681 (1924).
3. Katz, B. & Miledi, R., Vol. 207 1097-1098 (1965).
4. Katz, B. & Miledi, R. the Effect of Calcium on Acetylcholine Release From Motor Nerve Terminals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society (Great Britain) 161, 496-503 (1965).
5. Sarter, M., Parikh, V. & Howe, W.M. Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on. Nat Rev Neurosci 10, 383-390 (2009).
6. Hasselmo, M.E. Neuromodulation: Acetylcholine and memory consolidation. Trends in Cognitive Sciences 3, 351-359 (1999).
7. Picciotto, M.R., Higley, M.J. & Mineur, Y.S. Acetylcholine as a Neuromodulator: Cholinergic Signaling Shapes Nervous System Function and Behavior. Neuron 76, 116-129 (2012).
8. Klinkenberg, I., Sambeth, A. & Blokland, A., Vol. 221 430-442 (2011).
9. Lim, S.A.O., Kang, U.J. & McGehee, D.S. Striatal cholinergic interneuron regulation and circuit effects. Frontiers in Synaptic Neuroscience 6 (2014).
10. Jiang, L. et al. Cholinergic signaling controls conditioned fear behaviors and enhances plasticity of cortical-amygdala circuits. Neuron 90, 1057-1070 (2016).
11. Mash, D.C., Flynn, D.D. & Potter, L.T. Loss of M2 muscarine receptors in the cerebral cortex in Alzheimer`s disease and experimental cholinergic denervation. Science 228, 1115-1117 (1985).
12. Dineley, K.T., Pandya, A.A. & Yakel, J.L. Nicotinic ACh receptors as therapeutic targets in CNS disorders. Trends Pharmacol Sci 36, 96-108 (2015).
13. Wesson Ashford, J. Treatment of Alzheimer`s disease: the legacy of the cholinergic hypothesis, neuroplasticity, and future directions. J Alzheimers Dis 47, 149-156 (2015).
14. Baird, G.S., Zacharias, D.a. & Tsien, R.Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96, 11241-11246 (1999).
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