Nature | 高寧研究組與合作者發(fā)表DNA復(fù)制起點(diǎn)識別復(fù)合物3-Å分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)
2018年7月4號，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心高寧課題組與香港科技大學(xué)的戴碧瓘課題組合作，在《自然》（Nature）雜志以長文形式發(fā)表了題為“Structure of the origin recognition complex bound to DNA replication origin”的研究論文，報(bào)道了結(jié)合有復(fù)制起點(diǎn)DNA（ARS305）的釀酒酵母起點(diǎn)識別復(fù)合物（ORC）3-Å分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。此高分辨率結(jié)構(gòu)不僅為理解酵母ORC如何識別和結(jié)合序列特異性的DNA復(fù)制起點(diǎn)提供了分子基礎(chǔ)，同時也闡明了ORC如何通過彎曲DNA來進(jìn)一步加載DNA復(fù)制解旋酶MCM2-7的分子過程。
DNA復(fù)制起始在真核生物細(xì)胞體中受到嚴(yán)格精密的調(diào)控。DNA復(fù)制啟動因子首先結(jié)合到DNA復(fù)制起點(diǎn)，以加載DNA復(fù)制解旋酶MCM2-7復(fù)合物到DNA上，隨后MCM2-7被激活，DNA雙鏈被解螺旋，從而啟動DNA復(fù)制。真核生物的復(fù)制啟動因子ORC由六個亞基組成。所有真核生物都是利用ORC來標(biāo)記DNA復(fù)制起始的位點(diǎn)。除了在基因組穩(wěn)定性以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中顯而易見的重要作用，人源 ORC復(fù)合物的多個亞基（包括ORC1，ORC4，ORC6，Cdc6）的功能缺失突變都和一類罕見遺傳發(fā)育疾病直接相關(guān)（Meier-Gorlin syndrome，MGS）。MGS患者在胚胎期生長遲緩并伴隨多種發(fā)育畸形，出生后發(fā)育也嚴(yán)重受阻并導(dǎo)致身材矮小、小耳癥、膝蓋骨缺失。
雖然在不同的真核生物中，ORC的蛋白質(zhì)序列高度保守，但是ORC對DNA復(fù)制起點(diǎn)序列的選擇性在不同物種間差別很大。釀酒酵母的ORC可以識別特異的DNA復(fù)制起點(diǎn)，而人源細(xì)胞的ORC結(jié)合的DNA序列卻沒有序列特異性，主要依賴染色體結(jié)構(gòu)識別復(fù)制起點(diǎn)。ORC序列識別差異背后的分子機(jī)制，也一直是個未解之謎。造成這種局面一個很大的原因，就是多年來一直沒有ORC結(jié)合DNA的高分辨結(jié)構(gòu)。已經(jīng)發(fā)表的關(guān)于ORC結(jié)構(gòu)中，要么復(fù)合物中沒有DNA，要么分辨率較低，不足以提供足夠的細(xì)節(jié)信息，我們?nèi)匀粺o法推測ORC與DNA是如何相互作用從而實(shí)現(xiàn)其功能的。為了解開這個謎團(tuán)，高寧課題組和戴碧瓘課題組克服了一些技術(shù)問題，合作解析了釀酒酵母ORC結(jié)合DNA復(fù)制起始位點(diǎn)3-Å分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。
ORC-起點(diǎn)DNA復(fù)合物冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（a）以及復(fù)合物結(jié)構(gòu)中DNA在ACS以B1區(qū)域的兩次彎曲（b）
本文解析的ORC-ARS305 DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中，ARS305包含一段ARS高度保守序列（ARS consensus sequence, ACS）和一段B1元件序列，長度為72 bp。在這個結(jié)構(gòu)中，ORC的六個亞基通過與磷酸骨架的非特異性以及與堿基的特異性相互作用環(huán)繞DNA，并在ACS和B1位點(diǎn)使DNA發(fā)生彎曲。該結(jié)構(gòu)的一個關(guān)鍵特征是Orc1的保守堿性氨基酸區(qū)域（Orc1-BP，basic patch）深深地插入ACS的小溝中進(jìn)行序列特異的堿基識別。另外，酵母特有的具有物種特異性的位于Orc4 Wing Helix結(jié)構(gòu)域（WHD）中的Helix Insertion（Orc4-IH）嵌入ACS的大溝中，與相應(yīng)的堿基形成疏水相互作用。重要的是，在ACS區(qū)域形成的這些堿基特異的相互作用的堿基都非常保守。此外，在B1區(qū)域中，也有類似的來自O(shè)rc2和Orc5的堿性氨基酸區(qū)域插入到大溝和小溝中，與堿基相互作用，并使DNA彎曲。因此，釀酒酵母ORC高度序列特異性主要是通過ORC亞基的大溝、小溝插入基序與ACS保守堿基之間的特異性相互作用實(shí)現(xiàn)的。序列比對分析顯示，所有真核生物Orc1的N端都具有類似釀酒酵母的Orc1-BP；然而Orc4-IH卻只是在釀酒酵母中存在。這些發(fā)現(xiàn)，很大程度上解釋了不同物種ORC識別起始DNA特異性差異背后的原因。
北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心高寧教授以及香港科技大學(xué)的戴碧瓘教授、翟元樑博士（現(xiàn)為香港大學(xué)助理教授）為本文的共同通訊作者。高寧組的博士后李寧寧、博士生程稼萱以及戴碧瓘組的博士后林偉熙、研究員翟元樑為本文的共同第一作者。高寧組的成二超博士（2017年已畢業(yè)）和戴碧瓘組的趙永倩博士參與了研究工作。冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集工作主要在北京大學(xué)電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)室（冷凍電鏡平臺）完成，平臺的李雪梅老師和物理學(xué)院的余大啟博士在數(shù)據(jù)收集過程中提供了幫助；國家蛋白質(zhì)科學(xué)（北京）設(shè)施清華大學(xué)冷凍電鏡平臺為本課題的早期研究提供了支持。冷凍電鏡數(shù)據(jù)處理主要在北京大學(xué)高性能計(jì)算中心完成，平臺主管樊春老師提供了幫助。本論文獲得了科技部、自然科學(xué)基金委、香港研究資助局、中國博士后基金的經(jīng)費(fèi)支持。李寧寧獲得了北京大學(xué)-清華大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心優(yōu)秀博士后基金的資助。
高寧課題組和戴碧瓘課題組從2013年開始合作，在真核生物DNA復(fù)制起始調(diào)控機(jī)制的研究方面取得了很好的成果。先后解析了酵母DNA復(fù)制解旋酶雙六聚體復(fù)合物Mcm2-7的3.8-Å的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（Nature, 2015）以及解旋酶加載到DNA前游離的Mcm2-7六聚體和Cdt1-Mcm2-7七聚體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)（Nat Struct & Mol Biol, 2017）。
值得一提的是，這是北京大學(xué)冷凍電鏡平臺自2017年秋季正式運(yùn)行，其產(chǎn)出的研究成果首次在國際頂級期刊上發(fā)表。ORC-DNA復(fù)合物的分子量為400 kD左右，顆粒較小，分辨率可以達(dá)到3 Å，表明北京大學(xué)冷凍電鏡平臺的硬件建設(shè)已經(jīng)圓滿達(dá)成了初步目標(biāo)。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-018-0293-x
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