近日，美國芝加哥大學(xué)何川教授，上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院劉杰教授，與北京協(xié)和醫(yī)院等國內(nèi)多家單位合作發(fā)表于Cell Res的研究報道，利用何川教授發(fā)明的專利技術(shù)，特異性檢測結(jié)直腸癌、胃癌等多種腫瘤血中的循環(huán)游離DNA（cfDNA） 的一種新型修飾（5-羥甲基胞嘧啶，5hmC），靈敏度與特異性均達到90%左右。無獨有偶，美國科學(xué)院院士Stephen Quake教授與斯坦福醫(yī)學(xué)院、四川華西醫(yī)院等使用相同技術(shù)原理合作發(fā)表于Cell Res的另一項研究，也闡述了這一檢測的重大臨床應(yīng)用潛力。cfDNA 5hmC檢測是什么，為何引起了如此多的國際國內(nèi)學(xué)者的共同關(guān)注？讓我們從液體活檢說起。
液體活檢：腫瘤診療的顛覆性變革
液體活檢（liquid biopsy），即基于人體體液（主要是血液）中腫瘤的蛛絲馬跡來檢測全身腫瘤狀態(tài)的新興技術(shù)，與基于腫瘤組織的創(chuàng)傷活檢方法相比，液體活檢具有無創(chuàng)、簡單、可重復(fù)性高等優(yōu)點，更重要的是避免了因腫瘤異質(zhì)性帶來的組織活檢用于基因型檢測的不一致性，從而迅速成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代的寵兒。如能通過一管血完成腫瘤臨床診療的全程管理，毫無疑問將為腫瘤診療帶來顛覆性的變革。
正因為此，液體活檢技術(shù)被《麻省理工科技評論》（MIT Technology Review ）評為2015 年度十大突破技術(shù)，并被美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO）作為能夠改變未來十年癌癥治療的重要進展寫入2015年度進展報告。
液體活檢新靶標(biāo)：cfDNA 5hmC檢測
cfDNA是由腫瘤細胞死亡、凋亡或主動分泌進入血液循環(huán)系統(tǒng)的DNA片段，含有原發(fā)腫瘤的突變信息，在cfDNA上能檢測出基因點突變、拷貝數(shù)免疫、基因重組、外泌體中的 DNA，以及甲基化、羥甲基化表觀遺傳學(xué)改變，可被定性、定量和追蹤，用于多種腫瘤的早期診斷和實時監(jiān)控與評估病情。因此被作為新一代的腫瘤生物標(biāo)志物。
5hmC（5-hydroxymethylcyto- sine, 5-羥甲基胞嘧啶）是一種重要的DNA修飾方式，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5hmC可作為重要的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示，正常組織與腫瘤組織中5hmC的表達水平有顯著差異，且不同來源的腫瘤（如肺、結(jié)腸、胃、肝、卵巢、胰腺）會釋放不同5hmC修飾的cfDNA，提示其可能作為液體活檢的候選靶標(biāo)。
但由于5hmC不能使用傳統(tǒng)的亞硫酸鹽測序法（Bisulfite Sequencing）進行檢測，加之血液中cfDNA含量極低，如何實現(xiàn)對微量5hmC DNA的精確檢測，成為限制5hmC作為液體活檢靶標(biāo)的重要瓶頸。
何川教授開發(fā)的新型的hmC測序技術(shù)5hmC-Seal[Nat Biotechnol 2011]為cfDNA 5hmC用于液體活檢解決了技術(shù)難題。5hmC-Seal首先對測序接頭和生物素標(biāo)記5hmC進行連接，然后用鏈霉親和素磁珠捕獲含5hmC的cfDNA，直接進行PCR擴增建庫以減少洗脫純化所致樣本損失。經(jīng)研究者在cfDNA中的優(yōu)化，該技術(shù)可以對低至1,000個細胞 (納克級DNA) 的樣本繪制全基因組5hmC圖譜。
cfDNA 5hmC用于腫瘤檢測
通過與復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院劉杰教授的合作，并聯(lián)合國內(nèi)北京協(xié)和醫(yī)院等多家單位，此次研究共納入了90例健康人、260例癌癥患者（包括80例結(jié)直腸癌、71例胃癌、25例肝癌、34例胰腺癌、46例甲狀腺癌）和71例胃腸良性疾病。
研究者首次在我國常見腫瘤中展示了cfDNA 5hmC液體活檢的巨大潛力。
在結(jié)直腸癌中，研究者篩選出989個結(jié)直腸癌差異性5hmC位點（圖2A）。進一步對篩選出的差異性5hmC建立回歸模型，并對兩批獨立驗證cfDNA樣品繪制ROC特征曲線，結(jié)果提示，差異性cfDNA 5hmC用于結(jié)直腸癌診斷的靈敏度、特異度均可達80-90%（圖2C、D、E）。其在術(shù)后、I、II、III期患者中的假陰性率較低，IV期有低概率的假陰性率（與轉(zhuǎn)移灶對cfDNA 5hmC的影響有關(guān)），說明該差異性5hmC能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)直腸癌的早期診斷（圖2F）。
研究者同樣在胃癌患者血漿中篩選出了差異性5hmC，其在胃癌診斷中的靈敏度、特異度亦可達到90%(圖3C、D、E)，并且能夠?qū)崿F(xiàn)結(jié)胃癌的早期診斷（圖3F）。
研究者還在PDX小鼠模型中證實了cfDNA 5hmc的來源。PDX全稱為源于患者原代腫瘤組織的腫瘤移植模型，是當(dāng)前臨床前藥效評估和生物標(biāo)志物鑒定的最佳模型。研究者利用5hmC技術(shù)捕獲PDX小鼠血漿中的人源cfDNA序列，結(jié)果顯示，胃癌、腸癌PDX小鼠模型血漿中的人源cfDNA序列比例明顯高于對照小鼠，PDX模型中的血漿cfDNA 5hmC與供體腫瘤DNA 5hmC來源一致，患者血漿cfDNA差異性5hmC水平與PDX模型cfDNA水平一致，充分表明了患者游離血漿中5hmC的腫瘤來源。
5hmC作為一種穩(wěn)定的新型修飾位點，能夠在早期癌癥患者cfDNA中進行檢測，是作為液體活檢無創(chuàng)診斷的一個重大突破。中美學(xué)者合作證實，差異性5hmC是一種靈敏度、特異度高的腫瘤無創(chuàng)診斷標(biāo)志物，而且具有較高的組織特異性，是DNA修飾診斷的又一新碩果。
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