北理工在原核生物基因組編輯技術(shù)的優(yōu)化及應(yīng)用方面取得重要研究成果
近日，北京理工大學(xué)生命學(xué)院霍毅欣課題組在原核生物CRISPR基因組編輯技術(shù)的優(yōu)化及應(yīng)用方面再次取得重要研究成果，并發(fā)表于TOP（頂級(jí)）期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》。論文的第一作者為2019級(jí)博士生黃潮勇，通訊作者為霍毅欣教授，天工所張學(xué)禮和畢昌浩研究員、北理工馬曉焉特別副研究員參與了這項(xiàng)研究。該研究的部分工作在北理工—洛加大蘇州研究院聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室完成，項(xiàng)目獲得國(guó)家自然基金委面上項(xiàng)目、科技部重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、北京理工大學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目、以及蘇州工業(yè)園區(qū)的資助。該課題組不久前剛在Q1期刊《Microbial Cell Factories》上發(fā)表相關(guān)領(lǐng)域研究成果，論文的第一作者為2019屆碩士畢業(yè)生張姣，通訊作者為霍毅欣教授；植生所蔣宇研究員參與了這項(xiàng)研究。
CRISPR/Cas9作為新一代基因組編輯技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物以及微生物的基因組編輯。該技術(shù)利用化膿性鏈球菌來(lái)源的Cas9蛋白（SpCas9）產(chǎn)生位點(diǎn)特異性DNA雙鏈斷裂，再通過(guò)細(xì)胞的同源重組（HR）或非同源末端連接（NHEJ）機(jī)制修復(fù)雙鏈斷裂，同時(shí)在基因組上引入所需要的突變。與真核生物不同，原核生物普遍難以修復(fù)DNA雙鏈斷裂，絕大多數(shù)細(xì)菌缺乏NHEJ系統(tǒng)，而只具有效率很低的HR系統(tǒng)。因此，大多數(shù)研究者選擇將CRISPR/Cas9與重組工程相結(jié)合，通過(guò)過(guò)表達(dá)噬菌體來(lái)源的λ-Red系統(tǒng)（一種效率很高的HR系統(tǒng)）幫助原核生物修復(fù)DNA雙鏈斷裂，從而提高編輯效率。與NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯相比，HR介導(dǎo)的基因組編輯需要一個(gè)供體DNA作為編輯模板，這使基因組編輯操作變得復(fù)雜。研究表明，某些原核生物具有類(lèi)似真核生物的簡(jiǎn)化版NHEJ系統(tǒng)，這些NHEJ系統(tǒng)只需要兩個(gè)功能蛋白Ku和LigD。大腸桿菌一直以來(lái)被認(rèn)為缺乏NHEJ系統(tǒng)，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有研究者將結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌來(lái)源的NHEJ系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌，成功地開(kāi)發(fā)出了一種不依賴(lài)HR的基因組編輯方法用于快速刪除大腸桿菌基因組序列，大大加速了大腸桿菌遺傳改造的進(jìn)程。事實(shí)上，國(guó)外有研究者證明大腸桿菌具有一個(gè)類(lèi)似于NHEJ的末端連接系統(tǒng)（研究者將其命名為A-EJ），該系統(tǒng)的功能蛋白不是Ku和LigD，而是RecBCD和LigA。由于A-EJ修復(fù)DNA雙鏈斷裂的效率遠(yuǎn)低于NHEJ，目前還沒(méi)有利用A-EJ進(jìn)行基因組編輯的報(bào)道。是否有可能用A-EJ代替NHEJ進(jìn)行基因組編輯呢？答案是肯定的。
北京理工大學(xué)生命學(xué)院的霍毅欣教授課題組利用David Liu課題組開(kāi)發(fā)的 xCas9-3.7（SpCas9的進(jìn)化版突變體）和Jennifer Doudna課題組改造的sgRNA（tracrRNA : crRNA的強(qiáng)化版融合體）構(gòu)建了一個(gè)雙質(zhì)粒嚴(yán)謹(jǐn)誘導(dǎo)型的基因組編輯系統(tǒng)，并將其命名為CNEE。該系統(tǒng)極為簡(jiǎn)單，其功能組件只有Cas9和sgRNA，沒(méi)有任何外源的DNA修復(fù)蛋白，利用該系統(tǒng)，即使宿主的DNA修復(fù)系統(tǒng)效率極低，也能高效率地進(jìn)行基因組編輯。該課題組將CNEE系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌，在宿主A-EJ系統(tǒng)的協(xié)助下，實(shí)現(xiàn)了高效的基因敲除和長(zhǎng)達(dá)83 kb的大片段刪除（圖1）。這種方法不需要編輯模板，可以實(shí)現(xiàn)快速迭代的大腸桿菌遺傳改造，并且編輯效率不依賴(lài)于高轉(zhuǎn)化活性的宿主細(xì)胞。由于RecBCD和LigA（或它們的同源基因）在所有的原核生物中都存在，因此理論上CNEE系統(tǒng)適用于任何原核生物的基因組編輯。隨后，該課題組在CNEE的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個(gè)變異系統(tǒng)，為了方便描述，暫且把該系統(tǒng)稱(chēng)為CNEE-V1。將CNEE-V1導(dǎo)入大腸桿菌，可以在宿主RecA同源重組系統(tǒng)的協(xié)助下實(shí)現(xiàn)高效精確的基因組編輯，包括序列的刪除、插入和替換。CNEE-V1是對(duì)CNEE的有效補(bǔ)充；由于RecA（或它的同源基因）在所有的原核生物中都存在，因此理論上CNEE-V1也適用于任何原核生物的基因組編輯。此外，該課題組還證明，將分枝桿菌來(lái)源的NHEJ系統(tǒng)引入CNEE可以進(jìn)一步增強(qiáng)CNEE的性能；同樣，將噬菌體來(lái)源的λ-Red系統(tǒng)可以進(jìn)一步增強(qiáng)CNEE-V1的性能。相關(guān)成果發(fā)表于TOP（頂級(jí)）期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》，原文鏈接：https://doi.org/10.1007/s00253-019-10104-w
圖1 基于CNEE的基因組編輯流程
CRISPR/Cpf1是繼CRISPR/Cas9之后被開(kāi)發(fā)出來(lái)的基因組編輯系統(tǒng)。與CRISPR/Cas9相比，CRISPR/Cpf1脫靶率更低且所需的核酸酶和RNA分子更小，因此在基因組編輯領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，編輯效率相對(duì)較低限制了CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用。谷氨酸棒桿菌是一種重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株，此前，研究者利用CRISPR/Cpf1在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行基因組編輯的效率低于15%，且無(wú)法利用線(xiàn)性DNA作為修復(fù)模板。因此，該課題組針對(duì)谷氨酸棒桿菌的基因組編輯對(duì)CRISPR/Cpf1系統(tǒng)進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)包括PAM序列、間隔序列的長(zhǎng)度、修復(fù)模板的類(lèi)型。利用優(yōu)化后的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行基因組編輯的效率顯著提高，且可以利用線(xiàn)性DNA作為修復(fù)模板。隨后，該課題組利用優(yōu)化后的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)對(duì)野生型谷氨酸棒桿菌進(jìn)行遺傳改造，通過(guò)敲除基因pyc、ldh和adhA成功地提高了異丁酸的產(chǎn)量（圖2）。相關(guān)成果發(fā)表于《Microbial Cell Factories》，原文鏈接：https://doi.org/10.1186/s12934-019-1109-x
圖2 谷氨酸棒桿菌遺傳改造提高異丁酸產(chǎn)量
霍毅欣教授簡(jiǎn)介：
霍毅欣教授本科畢業(yè)于南開(kāi)大學(xué)，獲北京大學(xué)和巴黎七大雙博士學(xué)位，曾經(jīng)在法國(guó)巴斯德研究所、美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校等歐美科研院校和生物公司學(xué)習(xí)和工作十三年，兼有在學(xué)術(shù)界從事基礎(chǔ)研究和工業(yè)界開(kāi)展應(yīng)用轉(zhuǎn)化研究的經(jīng)歷。2016年起在北京理工大學(xué)組建代謝工程課題組，圍繞著“天然資源的微生物精煉與制造”，以“人工細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)-構(gòu)建-篩選-放大”為主線(xiàn)，以多種模式生物為研究對(duì)象，開(kāi)展了一系列研究，取得了多項(xiàng)研究成果。自2018年以來(lái)以通訊作者或第一作者身份在頂級(jí)期刊Nature Communications（1篇）、Metabolic Engineering（1篇）、Applied Microbiology and Biotechnology（4篇）、Current Opinion in Biotechnology（1篇）及重要期刊ACS Synthetic Biology（1篇）、Microbial Cell Factories（2篇）、Engineering（1篇）、Journal of Biotechnology （1篇）、JoVE（1篇）上發(fā)表論文，申請(qǐng)多項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利。
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁(yè)的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開(kāi)發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com