大道至簡，道法自然：《Science Advances》報(bào)道陳洪淵、黃碩團(tuán)隊(duì)無電極仿生納米孔芯片技術(shù)
自然界中廣泛存在的物質(zhì)跨膜輸運(yùn)現(xiàn)象通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換在分子水平上對諸多生物學(xué)過程進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。其中，無機(jī)離子，葡萄糖，核酸，氨基酸及其它細(xì)胞代謝物的跨膜輸運(yùn)需要由特定的膜通道蛋白介導(dǎo)完成。這些膜通道蛋白由蛋白質(zhì)單體或者多聚體于生物膜上自發(fā)組裝形成跨膜孔道。膜片鉗技術(shù)可以有效的逐個(gè)探究單個(gè)膜通道蛋白的生物物理學(xué)性質(zhì)。隨著越來越多新型的膜通道蛋白被發(fā)現(xiàn)，探究和理解，這些通道的門控動力學(xué)性質(zhì)與輸運(yùn)機(jī)制逐步得到了解讀。
新興的單分子納米孔技術(shù)正是建立在膜片鉗技術(shù)這一基礎(chǔ)上的膜通道仿生技術(shù)，其基本原理是利用電場力驅(qū)動單個(gè)分子或離子通過納米孔引起的皮安級電流變化來進(jìn)行單分子檢測。納米孔技術(shù)應(yīng)用廣闊，可以用于蛋白質(zhì)分析，金屬離子檢測，有機(jī)小分子識別，納米粒子表征，單分子化學(xué)，單分子質(zhì)譜以及DNA測序。然而，自1993年首個(gè)納米孔傳感概念的展示以來，無論納米孔技術(shù)的儀器形式如何變化，其檢測機(jī)理完全是來源于依賴膜片鉗技術(shù)的電信號檢測方法。雖然這種方法具有超高的時(shí)間分辨率（~10 μs）和電流分辨率（<0.1 pA），但受限于現(xiàn)有的微電子和微電極加工技術(shù)的技術(shù)門檻和成本限制，擴(kuò)大檢測通量是該領(lǐng)域的主要瓶頸?，F(xiàn)階段，單分子基因測序是納米孔傳感領(lǐng)域內(nèi)最重要的應(yīng)用，同時(shí)也伴隨著海量的數(shù)據(jù)采集需求，隨著納米孔測序技術(shù)產(chǎn)業(yè)化逐步展開，人們對超高通量納米孔測序（大于100萬個(gè)孔道）的需求愈發(fā)迫切，因此亟待發(fā)展一種新型的納米孔檢測模式，以不顯著提高檢測成本為前提突破現(xiàn)有檢測通量的局限。
數(shù)十億年的生物進(jìn)化過程早以篩選出一系列結(jié)構(gòu)最為精簡，運(yùn)轉(zhuǎn)最為高效的跨膜輸運(yùn)機(jī)制。T4噬菌體能專一地吸附在寄主細(xì)胞表面的相應(yīng)受體上, 將頭部的DNA通過中空的尾部（直徑為2.5～3.5 nm）注入宿主細(xì)胞內(nèi)。金黃色葡萄球菌分泌的α溶素 (α-HL) 能夠插到宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜上，導(dǎo)致細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)流失而溶解。與通過電極對并使用膜片鉗儀器驅(qū)動的納米孔技術(shù)不同，自然界中的跨膜運(yùn)輸過程往往自發(fā)產(chǎn)生，且完全不需要冗余的電極和膜片鉗等外圍電子器件的輔助，是最簡化的物質(zhì)跨膜輸運(yùn)分子機(jī)器。
圖1: 無電極納米孔技術(shù)原理與應(yīng)用。左上: 無電極納米孔技術(shù)示意圖。凝膠中的鈣離子自由擴(kuò)散穿過納米孔與液滴中的鈣離子熒光染料結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號。右上: 基于無電極納米孔技術(shù)的單分子傳感。分子穿過納米孔時(shí)會產(chǎn)生特異性的堵孔熒光信號，可用于環(huán)糊精、聚乙二醇和雙鏈DNA的傳感。左下: ClyA納米孔和α-HL 納米孔的同時(shí)成像與區(qū)分。由于孔徑不同 (ClyA納米孔: d = 3.6 nm, α-HL納米孔: d =1.4 nm)， ClyA納米孔在熒光模式下能產(chǎn)生一個(gè)明亮的亮斑（紅圈），而α-HL納米孔則表現(xiàn)為一個(gè)微弱的亮斑（黃圈）。右下: ClyA納米孔微液滴陣列。
受此啟發(fā)，我院生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳洪淵、黃碩團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種新型的納米孔檢測方法，并將其命名為無電極納米孔技術(shù)（DOP，DiffusiOptoPhysiology），也是世界首個(gè)無需電極的單分子納米孔檢測方法。該團(tuán)隊(duì)在納米孔的兩側(cè)分別加入鈣離子與鈣離子熒光染料，在濃度梯度驅(qū)動下，鈣離子自由擴(kuò)散穿過納米孔與熒光染料結(jié)合釋放熒光信號，從而間接實(shí)現(xiàn)納米孔在液滴-凝膠界面雙分子層上實(shí)時(shí)成像，并成功展示了其對小分子、高分子與生物大分子的單分子傳感。這項(xiàng)技術(shù)充分簡化了傳統(tǒng)的納米孔檢測模型（能斯特-普朗克方程，公式1），去掉了電遷移項(xiàng)在物質(zhì)傳遞中的貢獻(xiàn)，僅由擴(kuò)散、化學(xué)反應(yīng)和流體三項(xiàng)來描述物質(zhì)的傳遞(公式2)：
公式1（電生理納米孔檢測模型）：
公式2（DOP模型）：
通過進(jìn)一步對電解質(zhì)溶液與孔道優(yōu)化，其傳感性能可與傳統(tǒng)的電生理納米孔技術(shù)相當(dāng)，而理論檢測密度可高達(dá)104 pores/mm2。由于DOP無需預(yù)留電極空間，其測量體積可進(jìn)一步減小到~30 pL，檢測體積上是現(xiàn)有納米孔技術(shù)的百萬分之一，顯著降低了樣品消耗，非常適用于豐度極低的分析物測量。此外，不使用電極讓研究者可以很輕松的構(gòu)建微液滴DOP檢測陣列。這種檢測模式非常適用于多組分，平行化的高通量藥物篩選，其理論檢測密度可達(dá)103 bilayers/ mm2（圖1）。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了高通量可拋棄式單分子分析芯片，該芯片僅需簡單且無生物毒性的材料構(gòu)成，現(xiàn)有芯片成本不足1美元，非常適用于臨床檢測中的可拋棄式檢測需求，并有望進(jìn)入日常生活。
圖2：無電極大孔徑ClyA納米孔檢測dsDNA
該工作以“Electrode-free Nanopore Sensing by DiffusiOptoPhysiology”為題，于2019年9月6日在《Science Advances》發(fā)表相關(guān)論文（DOI: 10.1126/sciadv.aar3309，文章鏈接：https://advances.sciencemag.org/content/5/9/eaar3309）, 我院直博生王玉琴為該論文第一作者。我院陳洪淵院士與黃碩教授為該論文共同通訊作者。 此項(xiàng)研究得到了國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號：91753108、21327902、21675083）、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（國際科技合作促進(jìn)項(xiàng)目）（項(xiàng)目編號：020514380142、020514380174）、生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（項(xiàng)目編號：5431ZZXM1804、5431ZZXM1902）、南京大學(xué)卓越計(jì)劃 (項(xiàng)目編號:ZYJH004)、中組部青年海外高層次人才計(jì)劃、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進(jìn)計(jì)劃和南京大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目等經(jīng)費(fèi)支持。
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