《自然•通訊》報道鄭鵬課題組利用蛋白連接酶和切割酶可控的制備聚合蛋白質(zhì)分子
將多個蛋白質(zhì)分子交聯(lián)構(gòu)建成蛋白二聚體、三聚體甚至多聚體在生物技術(shù)、材料和制藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的生物材料，具有完美的生物相容性和功能多樣性等優(yōu)勢。而在生物制藥中，將蛋白類藥物分子與其他分子或蛋白交聯(lián)聚合也有著廣泛的應(yīng)用。目前聚合蛋白主要是利用巰基交聯(lián)的方式，該反應(yīng)聚合過程較難調(diào)控，因此得到的是聚合度不同的多聚蛋白混合物。其它利用蛋白連接酶的交聯(lián)方式，也存在著連接效率低，聚合度不可控等問題。
圖1. 通過聯(lián)用蛋白連接酶OaAEP1和蛋白切割酶TEV，我們可以將蛋白質(zhì)分子從單體逐步交聯(lián)，分別得到蛋白質(zhì)二聚體，三聚體，甚至十聚體。通過單分子力譜進(jìn)行的蛋白質(zhì)解折疊實驗，也在單個分子的層次上證明了該多聚蛋白含有設(shè)計的分子個數(shù)和正常的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可用于復(fù)雜蛋白體系例如金屬蛋白的多聚蛋白分子構(gòu)建和表征。
針對這些挑戰(zhàn)，近日南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院配位化學(xué)國家重點實驗室鄭鵬教授課題組通過一種高效的蛋白連接酶（oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases 1, OaAEP1）和一種經(jīng)典的蛋白切割酶（(tobacco etch virus, TEV）的聯(lián)用，成功的實現(xiàn)了多聚蛋白質(zhì)分子的可控聚合。從蛋白質(zhì)單體出發(fā)，可以依次分步合成二聚體、三聚體，甚至十聚體。體系中采用的蛋白酶在不同的pH和多種金屬離子的存在下都具有較高的活性，能夠廣泛的應(yīng)用到多種蛋白質(zhì)體系中，特別是那些需要在單體層次上進(jìn)行提存，含多個蛋白結(jié)構(gòu)域分子量過大容易錯誤折疊，以及含金屬離子的復(fù)雜蛋白質(zhì)體系中。同時，該連接反應(yīng)只需要分別在蛋白質(zhì)的單體N端引入兩個氨基酸GL和C端引入三個氨基酸NGL，就可以在二十分鐘內(nèi)迅速完成單步反應(yīng)，新形成的連接體對蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)影響極小。而且得到的多聚蛋白可以簡單高效表面固定化，為下游的表征和其他研究提供了便利。
同時我們采用以原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)為儀器的單分子力譜技術(shù)（single-molecule force spectroscopy, SMFS）對得到的多聚蛋白質(zhì)分子進(jìn)行了表征。在單個分子的層次下，驗證了的多聚蛋白內(nèi)的每個單體都具有和天然單體一致的結(jié)構(gòu)和力學(xué)穩(wěn)定性，不受引入連接序列的影響。另一個方面，我們的方法也為單分子科學(xué)的研究提供了一種長度可控的多聚蛋白質(zhì)樣品方法和樣品固定方法。
該工作以“Enzymatic Biosynthesis and Immobilization of Polyprotein Verified at the Single-Molecule Level”為題發(fā)表在Nature Communications. 2019, DOI: 10.1038/s41467-019-10696-x上。我院直博三年級研究生鄧逸冰同學(xué)為第一作者，碩士生吳韜為第二作者。鄭鵬教授為唯一通訊作者，新加坡南洋理工大學(xué)助理教授吳彬也參與了該項研究。此研究得到了國家自然科學(xué)基金（21771103）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費（14380171）、江蘇省雙創(chuàng)計劃和江蘇省自然科學(xué)基金（BK20160639）和配位化學(xué)國家重點實驗室等經(jīng)費的支持。
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