齊志、李丕龍、黃旭團(tuán)隊(duì)合作揭示FET家族融合致癌蛋白利用相分離提高轉(zhuǎn)錄的機(jī)理研究
轉(zhuǎn)錄是生命體中最重要的生命活動(dòng)之一，細(xì)胞對(duì)于轉(zhuǎn)錄的調(diào)控貫穿著從發(fā)育到衰老的整個(gè)過程，而一旦出現(xiàn)異常的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，則有可能導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。研究者們很早就發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)基因組在轉(zhuǎn)錄時(shí)會(huì)有不同區(qū)室產(chǎn)生，有轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域，也有轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域，并且這些區(qū)室在整個(gè)生命進(jìn)程中是動(dòng)態(tài)性變化的1。有趣的是，生物在進(jìn)化發(fā)育的過程中出現(xiàn)了很多具有一定功能和組成的無膜結(jié)構(gòu)，關(guān)于它們的形成機(jī)制一直以來并沒有得到很好的解釋。直到近些年“液液相分離”概念2的引入，才使得人們開始對(duì)這些無膜細(xì)胞器有了新的認(rèn)識(shí)，這個(gè)概念也在幫助人們逐漸認(rèn)識(shí)不同組成不同功能的轉(zhuǎn)錄聚集體。
FET（FUS/EWSR1/TAF15）融合蛋白可能是眾多參與形成轉(zhuǎn)錄聚集體的轉(zhuǎn)錄因子中比較特殊的一部分。FET蛋白家族的成員本身都是RNA結(jié)合蛋白，但是在很多肉瘤及白血病患者體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了由于染色體易位導(dǎo)致的新融合蛋白的形成。在這一類融合蛋白中，N端來自于FET蛋白家族的N端低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)域（Low complexity domain，LCD），C端主要來自于ETS蛋白家族的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）。已經(jīng)有研究表明融合蛋白的N端可以結(jié)合RNA聚合酶II（RNA polymerase II, Pol II）的C端結(jié)構(gòu)域（C terminal domain，CTD)，從而提高下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，這可能是癌癥發(fā)生的誘因之一3。2018年Robert Tjian課題組在Science雜志發(fā)表文章，他們?cè)诩?xì)胞內(nèi)通過超分辨成像技術(shù)觀察到FET家族融合蛋白EWS-FLI1在細(xì)胞核中形成聚集體并可以招募RNA聚合酶4。
近日，北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院定量生物學(xué)中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心齊志課題組與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李丕龍課題組以及英國(guó)格拉斯哥大學(xué)黃旭課題組合作在Nature Communications上在線發(fā)表題為L(zhǎng)oci specific phase separation of FET fusion proteins promotes gene transcription（FET融合蛋白在特異性靶標(biāo)位點(diǎn)形成相分離聚集促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄）的文章。
在該工作中，作者首先體外純化了EWS-FLI1這一被廣泛研究的FET家族融合致癌蛋白，它也是誘發(fā)尤因肉瘤（Ewing Sarcoma）的主要原因之一，以及模式體系FUS-Gal4并證明這兩種蛋白在體外可以和對(duì)應(yīng)的多乘DNA靶標(biāo)序列形成液態(tài)相分離液滴。然后作者利用最新發(fā)展的單分子生物物理技術(shù) – DNA簾幕（DNA Curtains）對(duì)相分離聚集體進(jìn)行研究。DNA簾幕技術(shù)5可以在體外將多個(gè)單根DNA分子鉚定在同一條線上，樣品池底部為一層類似于磷脂雙分子層的脂質(zhì)體，保證了DNA及蛋白在樣品池中的流動(dòng)性，通過微流系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣以及改變反應(yīng)條件，同時(shí)這項(xiàng)技術(shù)也具備高通量的特點(diǎn)，利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡（Total internal reflection fluorescence microscope, TIRFM）在一次實(shí)驗(yàn)中對(duì)多個(gè)DNA分子和蛋白分子的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行記錄。作者在噬菌體基因組中克隆了一段含有25′ GGAA的微衛(wèi)星序列，通過對(duì)EWS-FLI1進(jìn)行熒光標(biāo)記，比較靶標(biāo)位點(diǎn)處熒光強(qiáng)度隨蛋白濃度的變化確定了EWS-FLI1和FUS-Gal4在~100 nM的濃度下就可以在靶標(biāo)位點(diǎn)處形成具有液態(tài)性質(zhì)的聚集體，并且靶標(biāo)位點(diǎn)處形成的聚集體可以招募體外純化的RNA聚合酶II的CTD結(jié)構(gòu)域。之后，作者開發(fā)了一套基于DNA簾幕系統(tǒng)并依賴于FET融合蛋白聚集體體外轉(zhuǎn)錄的新技術(shù)。這個(gè)技術(shù)的核心想法是將來自于RNA聚合酶II的CTD部分與T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）融合表達(dá)并體外純化。當(dāng)FET融合蛋白在靶標(biāo)位點(diǎn)處形成聚集體后，T7 RNA聚合酶可通過RNA聚合酶II的CTD與FET融合蛋白N端的相互作用從而被招募到聚集體中起始轉(zhuǎn)錄。作者利用帶有熒光標(biāo)記的UTP對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA進(jìn)行標(biāo)記和分析，發(fā)現(xiàn)在多乘靶標(biāo)位點(diǎn)附近形成的聚集體處的轉(zhuǎn)錄活性最高，這為FET融合蛋白通過相分離參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性提供了體外因果性的證明（見圖1）。
圖1. DNA簾幕中依賴于FUS-Gal4融合蛋白聚集體的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。
?????? 除此之外，作者還通過不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在DNA簾幕上看到了融合蛋白尋找靶標(biāo)位點(diǎn)并在含有多乘靶標(biāo)位點(diǎn)的區(qū)域成核并聚集成液滴的過程，并測(cè)得了融合蛋白在發(fā)生聚集后動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的變化，以及靶標(biāo)序列數(shù)目對(duì)融合蛋白相分離強(qiáng)度影響的差異，并提出了DNA序列對(duì)相分離液滴形成強(qiáng)度的閾值理論，這些結(jié)論可以對(duì)相關(guān)癌癥的治療提供可能的幫助。
總結(jié)一下，本課題利用體外單分子技術(shù)系統(tǒng)地研究了FET融合蛋白在特異性靶標(biāo)位點(diǎn)形成相分離聚集促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制，并用該轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)一步證明DNA靶標(biāo)序列的數(shù)量可以對(duì)轉(zhuǎn)錄水平起到調(diào)控作用（見圖2）。我們探索出的多乘序列在這一轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中的重要性可以在相關(guān)癌癥的治療上提供幫助。
圖2. FET融合蛋白在特異性靶標(biāo)位點(diǎn)形成相分離聚集促進(jìn)下游基因轉(zhuǎn)錄的模型。
北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院定量生物學(xué)中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心齊志研究員、清華大學(xué)生命學(xué)院李丕龍研究員以及格拉斯哥大學(xué)黃旭研究員為本文的共同通訊作者。北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院生命科學(xué)聯(lián)合中心2016級(jí)博士生左琳彧為本文第一作者。清華大學(xué)生命學(xué)院張冠偉、格拉斯哥大學(xué)博士Matthew Massett為本研究做出重要貢獻(xiàn)，同時(shí)也感謝北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院定量生物學(xué)中心2018級(jí)博士生程軍、生命科學(xué)聯(lián)合中心2017級(jí)博士生郭梓聰、清華大學(xué)生命學(xué)院王亮博士等同學(xué)提供的大力幫助。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、清華大學(xué)高精尖結(jié)構(gòu)中心、以及國(guó)家基金委和英國(guó)皇家學(xué)院共同贊助的國(guó)際合作項(xiàng)目的資助。
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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-21690-7
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