Cell | 黃超蘭課題組與合作者利用新型絕對定量質譜法揭示CD3ε 的多重信號轉導功能
2020年7月29日，生命科學聯合中心、北京大學黃超蘭團隊，中科院上海生化與細胞所許琛琦團隊、美國加州大學圣地亞哥分校惠恩夫團隊，聯手在Cell上發(fā)表了題為“Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy”的論文，該研究通過開發(fā)基于質譜的絕對定量蛋白質組新方法，揭示了T細胞受體-共受體（TCR-CD3）復合物酪氨酸在不同抗原刺激下的動態(tài)磷酸化修飾全貌，解析了不同CD3鏈ITAM結構域磷酸化特征的奧秘，從中發(fā)現了其中一條亞基CD3ε的單磷酸化新功能，有望助力于設計全新的CAR-T療法。
TCR-CD3復合物在T細胞的發(fā)育、激活及對病原的免疫反應中起著決定性作用。這一重要作用來自于CD3鏈胞內端的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif-ITAM)。而ITAM的多樣性功能主要取決于其結構域的酪氨酸（Tyrosine）磷酸化，比如招募SYK激酶家族蛋白ZAP70進而激活下游的信號傳導。另外，ITAM的功能也被廣泛應用在對嵌合抗原受體（CAR）的研究中。其中CD3ζ亞鏈便常用于構建CAR-T細胞療法抗腫瘤活性，但其他CD3鏈的功能和對于CAR的設計也還有很多未知。
深入探索?CD3 ITAM的酪氨酸動態(tài)磷酸化模式可為全面理解不同CD3鏈的功能提供核心信息。TCR-CD3受體復合物有10個ITAM結構域分布著20個磷酸化位點----，在時間分辨率下實現對全部磷酸化位點的同時定量分析在技術上極具挑戰(zhàn)性。為了直觀比較不同TCR刺激下的磷酸化模式，精確繪制出TCR所有酪氨酸磷酸化的動態(tài)過程，黃超蘭團隊開發(fā)了一種新穎的絕對定量方法Targeted-IP-Multiplex-Light-Absolute-Quantitative?Mass Spectrometry（TIMLAQ-MS）。區(qū)別于目前報道的蛋白組絕對定量手段，不需要加入同位素重標的合成肽段，而是巧妙地利用串聯質量標簽（TMT），設計將6個標準樣品和4個分析樣品混合起來作為內標。標準樣品為不同濃度梯度的合成非重標磷酸化/非磷酸化CD3肽（A）和從未經抗原刺激的T細胞中通過IgG抗體免疫沉淀下來的背景蛋白（B）的混合物；用數據依賴采集（Data-dependent acquisition, DDA）結合平行反應監(jiān)測（Parallel reaction monitoring, PRM）的方式獲得抗原刺激下，TCR-CD3免疫沉淀（IP）復合物中不同酪氨酸位點的磷酸化/非磷酸化在不同時間點的定量結果。TIMLAQ?成功繞過了以前的定量方法中通常使用的同位素重標記肽，既節(jié)約了成本，又有效降低了方法的復雜性和數據采集誤差，進一步提高了定量準確性，最終可完全實現在一次測量中對不同時間點全部ITAM磷酸化修飾的絕對定量，描繪TCR-CD3復合物的酪氨酸動態(tài)磷酸化修飾全貌。
基于TIMLAQ-MS法的CD3 ITAM磷酸化修飾鑒定
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利用這一方法鑒定到在不同的TCR刺激條件下，CD3各亞基主要表現為雙磷酸化修飾模式，而唯獨CD3ε則呈現出單磷酸化修飾模式。前研究表明，雙磷酸化的ITAM與激酶家族蛋白ZAP70有很強的結合而激活下游信號傳導，而單磷酸化的ITAM則表現出很低的結合性。?本文中這一特殊的新發(fā)現驅使作者進一步深入探索CD3ε在TCR通路中的新潛在功能。結果顯示，單磷酸化的CD3ε可通過專門募集抑制性Csk激酶減弱TCR信號傳導，說明TCR中既有激活基元又有抑制基元，總體呈現為一種自制的信號傳導機制。作者團隊進一步深入研究，發(fā)現一旦將CD3ε細胞質結構域整合到第二代CAR中，CD3ε的ITAM結構域可以通過募集Csk減少CAR-T細胞因子的產生，而CD3ε的BRS結構域則可以通過募集p85促進CAR-T細胞的持久性。?總體而言，將CD3ε應用于CAR的設計可顯著提高CAR-T細胞的抗腫瘤活性。
從一個重要的基礎生物學問題開始，為解決問題而開發(fā)一個新穎方法，得到新發(fā)現，再深入探索生物學功能，最后有望貢獻在治療方法上。黃超蘭教授，許琛琦教授和惠恩夫教授作為本文的共同通訊作者，完美地演繹了不同交叉領域共同合作而產生的精彩結果。
黃超蘭教授是北京大學醫(yī)學部精準醫(yī)療多組學研究中心主任，北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院長聘副教授，北大-清華生命科學聯合中心研究員，曼徹斯特大學榮譽教授。近年來，黃超蘭教授帶領團隊積極開發(fā)基于質譜的蛋白質組學新方法，實驗室擁有國際領先的儀器、技術和方法，致力于為生物學和臨床研究中遇到的難題提供最有質量保證的全面蛋白質組和質譜技術手段。?僅從2015年至今，黃教授在高影響因子的雜志上就發(fā)表了近50篇文章?（目前已累計發(fā)表SCI論文80余篇），不但自己開發(fā)最前沿的質譜技術（迄今為止，課題組研發(fā)的單細胞蛋白質組技術，在單一體細胞中鑒定的蛋白數量是全球領域最高水平），更發(fā)揮了強大的合作力量，以她高超的質譜技術助力了眾多科學家的科研發(fā)展。曾協助美國普林斯頓大學教授，美國科學院外籍院士顏寧課題組，利用質譜技術有效分析了ACAT1蛋白周圍游離的脂質，為ACAT1作用底物的鑒定提供了最為直接有效的證據，相關工作發(fā)表在Nature上1。最重量級的是協助中科院院士，西湖大學校長施一公教授利用高分辨交聯質譜技術對剪接體復合物的成分和相互作用進行準確鑒定，促進了剪接體復合物在冷凍電鏡上的超高分辨率結構鑒定，相關工作發(fā)表在兩篇Science上2，3。
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參考文獻：
1?Qian et al., Nature, 2020; 581(7808):333-338
2?Yan et al., Science, 2015; 349(6253):1182-1191
3?Wan et al., Science, 2016; 351(6272):466-475
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