Nat. Commun.發(fā)表我院譚仁祥和戈惠明課題組在天然藥物生物合成中的重要進(jìn)展
生命科學(xué)學(xué)院、醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室譚仁祥和戈惠明教授團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室前期從海洋對蝦的腸道中分離得到一株海洋放線菌Streptomyces seoulensis A01，從該菌株的發(fā)酵液中分離到一個(gè)具有抗幽門螺旋桿菌活性的新穎大環(huán)內(nèi)酯化合物streptoseomycin (STM, 1) [Org. Lett.20, 2967–2971 (2018)]。前期該團(tuán)隊(duì)在鑒定其生物合成過程中，表征出了自然界首個(gè)可同時(shí)催化[6+4]/[4+2]環(huán)加成反應(yīng)的周環(huán)酶StmD [Nature568, 122–126 (2019)]。StmD催化生成的[6+4]和[4+2]產(chǎn)物可通過Cope重排相互轉(zhuǎn)化，且[6+4]環(huán)加成產(chǎn)物在熱力學(xué)上更穩(wěn)定。那么，在streptoseomycin的后續(xù)生物合成中，究竟是[6+4]還是[4+2]產(chǎn)物才事真正參與到STM的生物合成中呢？?
為了破解上述謎題，近日，該團(tuán)隊(duì)通過基因重組、體外酶反應(yīng)及量子化學(xué)計(jì)算鑒定了StmD下游的三個(gè)氧化還原酶StmO1、StmO2、StmK專一利用[6+4]產(chǎn)物，綜合利用酶促與非酶促級聯(lián)反應(yīng)高效構(gòu)建10/6/6三環(huán)骨架，相關(guān)成果“A [6+4]-cycloaddition adduct is the biosynthetic intermediate in streptoseomycin biosynthesis”在線發(fā)表在《自然-通訊》雜志上。?
研究者原本猜想，stm基因簇上是否存在烯酰還原酶直接還原[4+2]產(chǎn)物中α,β不飽和雙鍵，隨后氧化酶在C2位發(fā)生羥基化，生成化合物11（Fig. 1c,?path a）?；诖?，研究人員分析了這兩條基因簇并定位到三組高度保守的氧化還原酶StmO1/NgnO1、StmO2/NgnO2和StmK/NgnK。遺憾的是，敲除stmO1、stmO2和stmK均未累積化合物（Fig. 2）。研究者轉(zhuǎn)變思路，采用“bottom-up”策略將stmO1、stmO2和stmK逐個(gè)回補(bǔ)到只產(chǎn)生[6+4]和[4+2]產(chǎn)物的stmABCD菌株中，但同樣也沒有累積化合物。仔細(xì)分析stmO1-O2的編碼區(qū)，研究者注意到基因部分重疊，暗示stmO1-O2可能位于同一操縱子上。于是研究者完整克隆stmO1-O2并導(dǎo)入stmABCD菌中，果然發(fā)酵圖譜產(chǎn)生了三個(gè)新峰8，9，10（Fig. 2）。通過核磁鑒定了這三個(gè)化合物，有意思的是，8和9具有罕見的、異于終產(chǎn)物STM的6/6/6/6四環(huán)骨架。飼喂實(shí)驗(yàn)表明8-10都是支路產(chǎn)物, 無法恢復(fù)STM的產(chǎn)生。進(jìn)一步分析，研究者認(rèn)為10是StmO1-O2直接氧化5得到的，而8則是StmO1-O2氧化6生成的化合物不穩(wěn)定重排產(chǎn)生的。
既然無法直接從stmABCDO1O2菌株中獲取中間體，研究者猜想是否向其再導(dǎo)入下游基因就能捕獲中間體，得到穩(wěn)定的化合物。于是他們導(dǎo)入了NAD(P)H依賴的還原酶stmK，果然檢測到額外的新峰11（Fig. 2）。通過核磁數(shù)據(jù)研究人員確證11具有與終產(chǎn)物一致的10/6/6三環(huán)骨架，飼喂實(shí)驗(yàn)也表明11能夠恢復(fù)1的產(chǎn)生。以上數(shù)據(jù)表明只需stmABCDO1O2K七個(gè)基因就足夠產(chǎn)生中間體11。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證StmO1-O2、StmK的催化功能，研究人員對它們催化的反應(yīng)進(jìn)行了體外重構(gòu)（Fig. 3）。首先，他們獲得了StmO1-O2的同源蛋白NgnO1-O2，當(dāng)加入6/7和輔因子時(shí)，觀察到了化合物8、12和12b的產(chǎn)生。為了鑒定究竟是[6+4]還是[4+2]環(huán)加成產(chǎn)物才是其反應(yīng)底物，研究人員巧妙利用6的結(jié)構(gòu)類似物5作為底物，發(fā)現(xiàn)能夠生成10，充分說明[6+4]產(chǎn)物才是NgnO1-O2的反應(yīng)底物。最后研究人員將StmK直接加入NgnO1-O2的反應(yīng)體系中，“一鍋”反應(yīng)生成11。同時(shí)他們還重構(gòu)了StmK的逆反應(yīng)，當(dāng)加入11和輔因子時(shí)觀察到8和痕量12b的產(chǎn)生，進(jìn)一步佐證了StmK的功能。
基于以上結(jié)果，研究者對6到11的生物合成過程進(jìn)行了推測：StmO1-O2直接氧化6中sp3雜化的C2原子，生成化合物12，經(jīng)Cope重排迅速生成12a，再經(jīng)烯酮異構(gòu)變成12b（Fig. 1c,?path b）。此時(shí)，若StmK存在，12b會被還原產(chǎn)生中間體11。而當(dāng)StmK不存在時(shí)，12b會經(jīng)Alder-ene反應(yīng)自發(fā)生成支路產(chǎn)物8。?
為了更好地理解上述Cope重排、烯酮異構(gòu)和Alder-ene反應(yīng)之間的關(guān)系，研究人員通過密度泛函理論計(jì)算了反應(yīng)物、過渡態(tài)及產(chǎn)物的自由能（Fig. 4）。相比化合物10，化合物12發(fā)生Cope重排所需能壘更低，易于發(fā)生。進(jìn)一步計(jì)算表明，盡管發(fā)生Alder-ene反應(yīng)的能壘比Cope重排高，但由于生成8是放能過程，所以該反應(yīng)室溫下也容易發(fā)生。理論計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果相吻合。?
最后，研究人員獲得了StmO1-O2同源蛋白NtfO1-O2的蛋白晶體，有趣的是，它是一個(gè)異源二聚體結(jié)構(gòu)，這與前面StmO1-O2必須同時(shí)存在才能發(fā)揮作用相一致（Fig. 5）。通過分子對接和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，研究者初步確定了酶的活性中心，相關(guān)的催化機(jī)制正在研究。
綜上所述，研究者通過體內(nèi)基因重組、體外生化反應(yīng)、量子化學(xué)計(jì)算以及蛋白晶體學(xué)研究等，確證了[6+4]產(chǎn)物才是streptoseomycin生物合成過程真正的中間體。這一工作承上啟下完善了streptoseomycin的生物合成步驟，揭示了[6+4]環(huán)加成產(chǎn)物所扮演的重要角色，闡明自然界利用酶促與非酶促反應(yīng)相配合的策略，精準(zhǔn)地合成天然產(chǎn)物。?
南京大學(xué)王凱標(biāo)、王文和張博為該論文共同第一作者，生命科學(xué)學(xué)院戈惠明、譚仁祥和化學(xué)化工學(xué)院梁勇教授為共同通訊作者。該研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃，國家自然科學(xué)基金杰青項(xiàng)目、重大項(xiàng)目，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)和江蘇省雙創(chuàng)計(jì)劃等項(xiàng)目的資助。特別感謝南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)及配位化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，以及南京大學(xué)高性能計(jì)算中心提供的服務(wù)。
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文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-22395-7
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