最新研究成果 | 藥物潛在靶點新發(fā)現(xiàn)｜清華大學(xué)藥學(xué)院陳立功課題組發(fā)現(xiàn)維生素B2轉(zhuǎn)運蛋白SLC22A14調(diào)控精子細(xì)胞脂質(zhì)能量代謝及作用機(jī)制
時間：2021-04-22 00:43:02學(xué)院：藥學(xué)院學(xué)校：清華大學(xué)
2021年 4月 20日，清華大學(xué)藥學(xué)院陳立功課題組在《Cell Reports》雜志在線發(fā)表了題為《SLC22A14 is a mitochondrial riboflavin transporter required for sperm oxidative phosphorylation and male fertility》的研究論文，揭示了SLC22A14是作為精子細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)運蛋白，可以通過轉(zhuǎn)運核黃素調(diào)節(jié)長鏈脂肪酸β-氧化，從而維持精子內(nèi)的能量穩(wěn)態(tài)，其表達(dá)缺陷參與雄性不育疾病的發(fā)生。
? ? ? ? ? ? ? ? 圖1 SLC22A14調(diào)節(jié)精子能量代謝過程示意圖
不孕不育是一種非常普遍的疾病，影響著全球約7000萬人的生活。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，目前全世界的育齡夫婦中約有9%在與生育問題作斗爭，其中男性因素占約50%。少、弱精癥或畸形精子癥的高發(fā)是男性不育的主要原因，男性精子質(zhì)量呈逐年下降的趨勢已經(jīng)變成一項世界性問題。
溶質(zhì)載體（SLC）轉(zhuǎn)運蛋白家族是人類基因組中第二大膜蛋白家族，是細(xì)胞內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)運蛋白家族，可以分布在細(xì)胞內(nèi)從核膜到質(zhì)膜的各種生物膜結(jié)構(gòu)上。SLC 易感位點已被發(fā)現(xiàn)與多種代謝性疾病有強(qiáng)烈相關(guān)性，這些疾病包括胰島素抵抗、II型糖尿病、高血壓、慢性腎病、痛風(fēng)、哮喘、炎癥性腸病、癌癥、癡呆和焦慮癥等。SLC22A14是在哺乳動物中進(jìn)化保守的SLC22A亞家族成員，特異性地表達(dá)在雄性生殖細(xì)胞中。本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了Slc22a14 基因敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)雄性純合子敲除小鼠不育，然而SLC22A14 的生物學(xué)功能和底物卻完全未知，其致病機(jī)制尚不清楚。
? ? ? ? ? ? ? ? 圖1 SLC22A14調(diào)節(jié)精子能量代謝過程示意圖
不孕不育是一種非常普遍的疾病，影響著全球約7000萬人的生活。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，目前全世界的育齡夫婦中約有9%在與生育問題作斗爭，其中男性因素占約50%。少、弱精癥或畸形精子癥的高發(fā)是男性不育的主要原因，男性精子質(zhì)量呈逐年下降的趨勢已經(jīng)變成一項世界性問題。
溶質(zhì)載體（SLC）轉(zhuǎn)運蛋白家族是人類基因組中第二大膜蛋白家族，是細(xì)胞內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)運蛋白家族，可以分布在細(xì)胞內(nèi)從核膜到質(zhì)膜的各種生物膜結(jié)構(gòu)上。SLC 易感位點已被發(fā)現(xiàn)與多種代謝性疾病有強(qiáng)烈相關(guān)性，這些疾病包括胰島素抵抗、II型糖尿病、高血壓、慢性腎病、痛風(fēng)、哮喘、炎癥性腸病、癌癥、癡呆和焦慮癥等。SLC22A14是在哺乳動物中進(jìn)化保守的SLC22A亞家族成員，特異性地表達(dá)在雄性生殖細(xì)胞中。本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了Slc22a14 基因敲除的小鼠，發(fā)現(xiàn)雄性純合子敲除小鼠不育，然而SLC22A14 的生物學(xué)功能和底物卻完全未知，其致病機(jī)制尚不清楚。
作者首先利用CASA系統(tǒng)和體外受精試驗分析發(fā)現(xiàn)了Slc22a14敲除引發(fā)精子的運動力嚴(yán)重受損，致使精子無法穿透透明帶使卵母細(xì)胞受精。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Slc22a14敲除導(dǎo)致精子內(nèi)ATP水平顯著降低，表明其在某種程度上參與了精子的能量代謝。精子的運動主要依靠鞭毛主段的擺動產(chǎn)生助推作用，而鞭毛主段富含糖酵解酶類，因此一直以來，精子尾部的糖酵解被認(rèn)為是人類和小鼠精子運動的主要能量來源。然而，越來越多的證據(jù)表明脂肪酸代謝在精子能量生成中的重要性。
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針對附睪尾部精子的代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析表明Slc22a14敲除的精子內(nèi)長鏈脂肪酸氧化和TCA循環(huán)的中間代謝物顯著減少，并且發(fā)生了長鏈游離脂肪酸和甘油三酯的蓄積，而糖酵解過程發(fā)生代償性升高。作者采用放射性和非放射性同位素示蹤技術(shù)，檢測了碳同位素標(biāo)記的葡萄糖和脂肪酸底物在精子內(nèi)的代謝情況，同時評估了精子細(xì)胞耗氧量和胞外產(chǎn)酸值的變化，最終證實Slc22a14敲除誘發(fā)精子內(nèi)長鏈脂肪酸β-氧化（FAO）和氧化磷酸化（OXPHOS）缺陷，并且糖脂代謝途徑發(fā)生重排。此外，作者發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸約占精子內(nèi)總脂質(zhì)含量的25%，并且多種FAO相關(guān)蛋白質(zhì)在精子內(nèi)呈高豐度表達(dá)；盡管FAO產(chǎn)ATP量只占正常精子ATP生成總量的30%，但它對精子的運動和生育能力是不可或缺的。
作為轉(zhuǎn)運蛋白，SLC22A14的細(xì)胞內(nèi)定位是什么以及通過轉(zhuǎn)運何種底物來發(fā)揮作用的呢？針對這一問題，作者利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)和超高分辨率顯微成像技術(shù)證實SLC22A14是定位于精子線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運蛋白。精子是高度特化的一類細(xì)胞，在體外無法大量擴(kuò)增，并且存活時間短，很難分離出有活性的線粒體。因此，作者采用基因過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系作研究模型，結(jié)合線粒體代謝組學(xué)、放射性或非放射性同位素標(biāo)記底物攝取實驗以及核黃素缺乏小鼠模型，鑒定出核黃素為SLC22A14的可能底物。核黃素是FMN和FAD的前體，是FAO、TCA 循環(huán)、電子傳遞鏈復(fù)合物I 和II的輔因子；此外，作為抗氧化劑，核黃素還可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。Slc22a14基因敲除干擾了核黃素進(jìn)入線粒體基質(zhì)的運輸過程，導(dǎo)致FMN和FAD耗竭和黃素酶活性降低，從而抑制ATP的合成，誘發(fā)精子功能損傷以及雄性不育。
圖2? SLC22A14位于線粒體內(nèi)膜，通過轉(zhuǎn)運核黃素介導(dǎo)精子的長鏈脂肪酸氧化過程并影響精子的受精能力
該研究首次對精子這一特殊細(xì)胞類型的能量代謝展開較為系統(tǒng)的研究，填補了精子能量代謝領(lǐng)域和線粒體核黃素轉(zhuǎn)運蛋白研究領(lǐng)域的部分空白。一方面，作為精子特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)運蛋白，SLC22A14可以潛在地應(yīng)用到以控制精子代謝為靶標(biāo)的男性避孕藥的開發(fā)；另一方面，對SLC22A14的研究可為臨床男性不育診治提供理論依據(jù)。
清華大學(xué)藥學(xué)院陳立功研究員為本文的通訊作者。藥學(xué)院已畢業(yè)博士生匡文華為本文第一作者。實驗室成員張杰、蘭洲、馬志龍、程麗麗、趙心彬、羅琪和孟子裔，新加坡A*STAR研究所范昊研究員、中科院動物所李衛(wèi)研究員、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院紀(jì)家奎研究員等為本項研究工作做出了重要貢獻(xiàn)。此項工作得到比爾梅琳達(dá)蓋茨基金會、科技部重點研發(fā)計劃、國自然基金委重大研究計劃和北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心的基金支持。
作為轉(zhuǎn)運蛋白，SLC22A14的細(xì)胞內(nèi)定位是什么以及通過轉(zhuǎn)運何種底物來發(fā)揮作用的呢？針對這一問題，作者利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)和超高分辨率顯微成像技術(shù)證實SLC22A14是定位于精子線粒體內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運蛋白。精子是高度特化的一類細(xì)胞，在體外無法大量擴(kuò)增，并且存活時間短，很難分離出有活性的線粒體。因此，作者采用基因過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系作研究模型，結(jié)合線粒體代謝組學(xué)、放射性或非放射性同位素標(biāo)記底物攝取實驗以及核黃素缺乏小鼠模型，鑒定出核黃素為SLC22A14的可能底物。核黃素是FMN和FAD的前體，是FAO、TCA 循環(huán)、電子傳遞鏈復(fù)合物I 和II的輔因子；此外，作為抗氧化劑，核黃素還可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。Slc22a14基因敲除干擾了核黃素進(jìn)入線粒體基質(zhì)的運輸過程，導(dǎo)致FMN和FAD耗竭和黃素酶活性降低，從而抑制ATP的合成，誘發(fā)精子功能損傷以及雄性不育。
圖2? SLC22A14位于線粒體內(nèi)膜，通過轉(zhuǎn)運核黃素介導(dǎo)精子的長鏈脂肪酸氧化過程并影響精子的受精能力
該研究首次對精子這一特殊細(xì)胞類型的能量代謝展開較為系統(tǒng)的研究，填補了精子能量代謝領(lǐng)域和線粒體核黃素轉(zhuǎn)運蛋白研究領(lǐng)域的部分空白。一方面，作為精子特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)運蛋白，SLC22A14可以潛在地應(yīng)用到以控制精子代謝為靶標(biāo)的男性避孕藥的開發(fā)；另一方面，對SLC22A14的研究可為臨床男性不育診治提供理論依據(jù)。
清華大學(xué)藥學(xué)院陳立功研究員為本文的通訊作者。藥學(xué)院已畢業(yè)博士生匡文華為本文第一作者。實驗室成員張杰、蘭洲、馬志龍、程麗麗、趙心彬、羅琪和孟子裔，新加坡A*STAR研究所范昊研究員、中科院動物所李衛(wèi)研究員、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院紀(jì)家奎研究員等為本項研究工作做出了重要貢獻(xiàn)。此項工作得到比爾梅琳達(dá)蓋茨基金會、科技部重點研發(fā)計劃、國自然基金委重大研究計劃和北京市結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心的基金支持。
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