張文彬課題組在拓?fù)涞鞍踪|(zhì)的合成和表征方面取得重要進(jìn)展
受限于核糖體的線(xiàn)性模板合成機(jī)制，化學(xué)拓?fù)湓诘鞍踪|(zhì)工程中一直是相對(duì)被忽視的話(huà)題。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多具有非線(xiàn)性結(jié)構(gòu)的天然拓?fù)涞鞍踪|(zhì)。它們通常具有與其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的功能優(yōu)勢(shì)，在生命活動(dòng)中行使著重要的角色，發(fā)揮著不可或缺的作用。這引起業(yè)內(nèi)對(duì)蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)調(diào)控的廣泛興趣。近年來(lái)，發(fā)展拓?fù)涞鞍踪|(zhì)的制備方法，并探究其結(jié)構(gòu)性能關(guān)系和相關(guān)應(yīng)用，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)工程的熱門(mén)方向。
北京大學(xué)張文彬課題組近期在拓?fù)涞鞍踪|(zhì)的合成和表征方面取得重要進(jìn)展。他們通過(guò)模擬天然拓?fù)涞鞍踪|(zhì)合成中的多步翻譯后修飾過(guò)程，基于合理的基因序列設(shè)計(jì)，結(jié)合原位組裝、鏈斷裂和正交的定點(diǎn)環(huán)化反應(yīng)，發(fā)展了一種高效的蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴的生物合成方法，不需要額外的胞外反應(yīng)過(guò)程，通過(guò)直接表達(dá)、純化即可制備蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴。該方法主要利用p53dim結(jié)構(gòu)域(X)的分子內(nèi)二聚來(lái)引導(dǎo)同一基因片段中兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的異質(zhì)二聚，通過(guò)共表達(dá)蛋白酶進(jìn)行原位酶切斷鏈，同時(shí)利用可基因編碼的蛋白質(zhì)定點(diǎn)偶聯(lián)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)環(huán)化合成蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴。例如，他們利用諜標(biāo)簽(A)-諜捕手(B)反應(yīng)對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)側(cè)鏈偶聯(lián)環(huán)化，通過(guò)原位酶切激活分離型內(nèi)含肽(IntC1/IntN1)介導(dǎo)的主鏈偶聯(lián)環(huán)化反應(yīng)，構(gòu)建了具有支化結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴，并容許通過(guò)基因工程的手段模塊化地融合各種目標(biāo)蛋白質(zhì)（圖1）。
圖1. 通過(guò)原位酶切、諜標(biāo)簽-諜捕手反應(yīng)對(duì)和分離型內(nèi)含肽共同介導(dǎo)（支化）蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴的生物合成
為進(jìn)一步簡(jiǎn)化合成過(guò)程，他們基于分離型內(nèi)含肽在反應(yīng)時(shí)會(huì)自身從主鏈上切除下來(lái)的特性，設(shè)計(jì)了由兩種正交的分離型內(nèi)含肽介導(dǎo)的環(huán)化過(guò)程，其可以在胞內(nèi)次序發(fā)生反式剪接和自發(fā)鏈斷裂，從而消除了原位酶切反應(yīng)的必要性，并可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的主鏈環(huán)化，制備結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)潔的蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴（圖2）。X射線(xiàn)單晶衍射實(shí)驗(yàn)成功解析了利用該方法制備的cat-GFPX-X的晶體結(jié)構(gòu)，有力地證明了其中兩個(gè)環(huán)狀組分之間機(jī)械互鎖的空間關(guān)系（圖3）。這也是第一個(gè)人工設(shè)計(jì)合成的蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴的晶體結(jié)構(gòu)。
圖2. 由兩種正交的分離型內(nèi)含肽介導(dǎo)蛋白質(zhì)異質(zhì)索烴的生物合成
圖3. (a)利用X射線(xiàn)衍射解析所得cat-GFPX-X晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 7BWN)；(b) cat-GFPX-X晶體結(jié)構(gòu)中兩個(gè)p53dim結(jié)構(gòu)域的相互作用界面分析
該方法的優(yōu)勢(shì)在于其可基因編碼，高度模塊化，且合成過(guò)程無(wú)需額外控制，在細(xì)胞內(nèi)直接自發(fā)完成，既大大簡(jiǎn)化了合成步驟，又有效提高了產(chǎn)物的純度。它適用于胞內(nèi)合成含有多種功能蛋白質(zhì)的異質(zhì)索烴，并可拓展到各種具有支化結(jié)構(gòu)的異質(zhì)索烴。相較于同質(zhì)索烴，它們的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和多樣性進(jìn)一步提高，有望更好地實(shí)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同，深入地探討拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)分子性質(zhì)和功能的影響，在工業(yè)酶工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。
該研究近期在線(xiàn)發(fā)表于Angew. Chem. Int. Ed.，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士生劉雅杰、方晶和生命科學(xué)學(xué)院博士生段澤林為該論文共同第一作者。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士生張凡也為本工作做出了貢獻(xiàn)。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院張文彬教授和生命科學(xué)學(xué)院肖俊宇研究員為共同通訊作者。該工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、科技部、北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心創(chuàng)新項(xiàng)目和北京大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)+X青年專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目的支持。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202005490
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