我院在i-DNA研究領(lǐng)域取得新進(jìn)展
i-DNA也即i-motif DNA，是1993年發(fā)現(xiàn)的一種由富含胞嘧啶序列形成的非典型四鏈體核酸結(jié)構(gòu)（圖1A）。近年來，越來越多的證據(jù)表明i-DNA結(jié)構(gòu)在人細(xì)胞核中能保持穩(wěn)定，i-DNA的形成序列在基因組中廣泛存在，尤其集中在癌癥基因啟動(dòng)子區(qū)域。盡管該結(jié)構(gòu)具有維持端粒長(zhǎng)度、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等一系列重要的生理功能，且作為一類新型的抗癌靶點(diǎn)得到廣泛關(guān)注，但實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過的i-DNA形成序列至今總數(shù)不超過230條。極其有限的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)致當(dāng)前科學(xué)界對(duì)i-DNA結(jié)構(gòu)形成的序列多樣性缺乏足夠的認(rèn)知，甚至不同實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的數(shù)據(jù)中出現(xiàn)了相互矛盾的結(jié)果。此外，大多數(shù)關(guān)于i-DNA結(jié)構(gòu)的研究都集中細(xì)胞外，這導(dǎo)致科學(xué)界缺乏對(duì)細(xì)胞內(nèi)/外i-DNA結(jié)構(gòu)性質(zhì)的統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，由此產(chǎn)生疑惑：細(xì)胞外的數(shù)據(jù)能否代表細(xì)胞內(nèi)的性質(zhì)？
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圖1.（A）分子內(nèi)i-DNA三維結(jié)構(gòu)示意圖；（B）半質(zhì)子化胞嘧啶-胞嘧啶堿基對(duì)（C·C+）。
為了厘清序列對(duì)i-DNA結(jié)構(gòu)的影響，并探究i-DNA在細(xì)胞內(nèi)/外穩(wěn)定性，我院Jean-Louis Mergny特聘教授和周俊副教授研究組設(shè)計(jì)了近300條序列，系統(tǒng)考察了半質(zhì)子化胞嘧啶-胞嘧啶堿基對(duì)（C·C+, 圖1B）數(shù)量、環(huán)狀區(qū)域的堿基數(shù)量和組成、末端序列的位置和堿基組成等對(duì)i-DNA熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的影響。該工作還基于大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過機(jī)器學(xué)習(xí)首次構(gòu)建了i-DNA穩(wěn)定性的數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型。
研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)環(huán)狀區(qū)域的總長(zhǎng)度對(duì)i-DNA穩(wěn)定性幾乎沒有明顯影響（圖2A）。作為對(duì)比，G-四鏈體穩(wěn)定性隨著環(huán)狀區(qū)域總長(zhǎng)度的延長(zhǎng)而單調(diào)遞減。因此，在揭示基因組中搜索i-DNA和G-四鏈體的形成序列時(shí)，尤其要注意環(huán)狀區(qū)域序列對(duì)這兩種結(jié)構(gòu)的不同影響。同時(shí)，當(dāng)中間環(huán)狀區(qū)域相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)，i-DNA的穩(wěn)定性會(huì)更高（圖2B），這個(gè)結(jié)論與該研究組之前關(guān)于G-四鏈體的發(fā)現(xiàn)是類似的（Nucleic Acids Res., 2018, 46, 9264-9275）。此外，i-DNA穩(wěn)定性會(huì)隨著C·C+堿基對(duì)數(shù)量增加而增加，但是增加量會(huì)逐漸衰減（圖2C）。
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圖2.（A）環(huán)狀區(qū)域總長(zhǎng)度,（B）環(huán)狀區(qū)域的相對(duì)排列，（C）C·C+堿基對(duì)數(shù)量對(duì)i-DNA穩(wěn)定性的影響。
該研究團(tuán)隊(duì)還通過對(duì)比細(xì)胞內(nèi)外NMR譜圖（圖3），發(fā)現(xiàn)部分i-DNA不僅可以穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)，其細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性也明顯高于其在溶液中的穩(wěn)定性。細(xì)胞內(nèi)外的i-DNA穩(wěn)定性表現(xiàn)出高度的一致性，即在溶液中具有較高穩(wěn)定性的i-DNA，其在細(xì)胞內(nèi)也具有較高的穩(wěn)定性。
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圖3. 細(xì)胞內(nèi)NMR測(cè)試后的（A）共聚焦顯微鏡圖和（B）雙染色FCM分析；（C）溶液與（D）細(xì)胞內(nèi)變溫NMR譜圖。
圓二色（CD）和熱差譜（TDS）是表征i-DNA結(jié)構(gòu)最常用的兩種基本方法。然而長(zhǎng)期以來，譜圖的解析卻缺乏深刻認(rèn)識(shí)?；趯?shí)驗(yàn)中獲得的大量CD和TDS數(shù)據(jù)，通過多元數(shù)據(jù)分析，首次發(fā)現(xiàn)C·C+堿基對(duì)作為構(gòu)成i-DNA結(jié)構(gòu)的核心成份決定CD和TDS譜的主要峰形，而環(huán)狀區(qū)域主要影響主峰之間的過渡區(qū)域（圖4）。
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圖4.?CD譜圖的多元數(shù)據(jù)分析。（A，B）C·C+堿基對(duì)數(shù)量，（C，D）環(huán)狀區(qū)域總長(zhǎng)度，（E，F）中間環(huán)狀區(qū)域長(zhǎng)度。
這項(xiàng)工作使得i-DNA研究序列數(shù)量成倍增加，并對(duì)i-DNA的光譜特征提供了詳盡的理論解釋。研究結(jié)果以研究全文的形式背對(duì)背投稿到Angew. Chem.雜志，得到了多位審稿人的高度評(píng)價(jià)：“i-motif研究領(lǐng)域最系統(tǒng)的研究，并將有助于解決該領(lǐng)域的多個(gè)難題”以及“i-motif研究領(lǐng)域的里程碑”。該工作有助于研究人員深刻理解i-DNA的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上為進(jìn)一步構(gòu)建i-DNA數(shù)據(jù)庫(kù)、開發(fā)基因組層次上的i-DNA信息檢索方法，以及合理設(shè)計(jì)基于i-DNA結(jié)構(gòu)的核酸納米器件等方面具有實(shí)際指導(dǎo)意義。
該工作由Jean-Louis Mergny教授和周俊副教授發(fā)起，細(xì)胞內(nèi)外核磁、機(jī)器學(xué)習(xí)和光譜分析分別得到捷克馬薩里克大學(xué)Luká? Trantírek課題組，英國(guó)牛津大學(xué)Aleksandr B. Sahakyan課題組，意大利那不勒斯大學(xué)Antonio Randazzo課題組的大力支持。我院鞠熀先教授參與了課題的討論并給出了重要的指導(dǎo)。研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、南京大學(xué)、中央高校業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)和生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)費(fèi)支持。
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論文信息：
1.?????? Mingpan Cheng,?Dehui Qiu,Liezel Tamon,Eva I?tvánková,Pavlína Ví?ková,Samir Amrane,Aurore Guédin,Jielin Chen,Laurent Lacroix,Huangxian Ju,Luká? Trantírek,Aleksandr B. Sahakyan,Jun Zhou,?and Jean-Louis Mergny. Thermal and pH stabilities of i-DNA: confronting in vitro experiments with models and in-cell NMR data. Angew. Chem., Int. Ed. 2021, DOI: 10.1002/anie.202016801.
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2.?????? Nunzia Iaccarino, Mingpan Cheng, Dehui Qiu, Bruno Pagano, Jussara Amato, Anna Di Porzio, Jun Zhou, Antonio Randazzo, and Jean-Louis Mergny, Effects of sequence and base composition on the CD and TDS profiles of i-DNA.Angew. Chem., Int. Ed. 2021, DOI: 10.1002/anie.202016822.
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