Cell | 杜鵬課題組揭示通過(guò)抑制剪接體捕獲和維持小鼠全能性干細(xì)胞
小鼠胚胎發(fā)育由合子開始，經(jīng)過(guò)2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞和桑椹胚，形成囊胚，之后繼續(xù)發(fā)育形成胚內(nèi)和胚外組織。具有最高潛能的干細(xì)胞被稱為全能性干細(xì)胞，一般指體內(nèi)的合子，2/4細(xì)胞，它可以發(fā)育到胚內(nèi)和胚外組織。多能性干細(xì)胞，一般來(lái)源于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，它的發(fā)育潛能是受限的，只能發(fā)育到胚內(nèi)組織。1981年，人們首次在體外成功分離了第一株小鼠多能性胚胎干細(xì)胞系（ESC）。直到40年后的今天，所有培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞都處于多能狀態(tài)，人們一直致力于體外建立發(fā)育潛能更高的干細(xì)胞。表達(dá)全能性基因Zscan4s和Mervl的2C-like細(xì)胞是最早報(bào)道的能夠產(chǎn)生胚內(nèi)和胚外組織的細(xì)胞[1]。但是，2C-like細(xì)胞在培養(yǎng)基中是亞穩(wěn)態(tài)的，僅以極低的百分比（0.1％-1％）存在。2017年，兩個(gè)研究小組報(bào)道使用不同的化學(xué)小分子混合物建立了擴(kuò)展型多能干細(xì)胞（Expanded (or extended) pluripotent stem cell，EPSC），具有胚內(nèi)和胚外雙向分化潛能?[2, 3]。但是，這種擴(kuò)展型多能性干細(xì)胞的分子特征和功能等方面和體內(nèi)真正的全能性胚胎細(xì)胞仍存在較大差距[4]。迄今為止，人們無(wú)法在體外捕獲和維持分子和功能上與體內(nèi)全能性胚胎相似的全能性干細(xì)胞，因此也就無(wú)法真正利用體外細(xì)胞培養(yǎng)體系研究著床前胚胎發(fā)育過(guò)程，并且導(dǎo)致胚外組織的體外分化及相關(guān)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用等方面也存在極大的局限性。
2021年5月14日，北京大學(xué)杜鵬課題組在Cell雜志在線發(fā)表了題為“Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression”的研究論文。在這項(xiàng)研究中，作者通過(guò)抑制剪接體，實(shí)現(xiàn)了小鼠全能性干細(xì)胞的體外建立和培養(yǎng)，且這種細(xì)胞在分子和功能上接近體內(nèi)2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期胚胎，因此被命名為totipotent blastomere-like cells（TBLCs）。
在本研究工作中，作者主要有以下發(fā)現(xiàn)：
1、剪接體抑制驅(qū)動(dòng)多能干細(xì)胞到全能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)變
作者分析了先前發(fā)表的單細(xì)胞胚胎數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)剪接因子在早期胚胎發(fā)育中是動(dòng)態(tài)變化的，有一類剪接因子在胚胎發(fā)育早期低表達(dá)，在后期表達(dá)量逐漸升高。作者發(fā)現(xiàn)敲低這一類關(guān)鍵剪接因子能廣泛激活全能性基因（如Zscan4s，Plk2，Btg1/2以及轉(zhuǎn)座子Mervl和Mt2），沉默多能性基因（如Utf1，Tdgf1，Sox2），將小鼠多能性的ESC重編程為全能性狀態(tài)。同時(shí)，將剪接抑制劑Pladienolide B（PlaB）添加到Serum/ LIF培養(yǎng)基中（SLP培養(yǎng)基），能夠在體外培養(yǎng)和維持TBLC，且細(xì)胞活性和核型正常。與PSCs (pluripotent stem cells) (P0)相比，在SLP培養(yǎng)基中培養(yǎng)5代之后，整體轉(zhuǎn)錄組趨于穩(wěn)定，特異性表達(dá)胚胎時(shí)期的全能性基因，沉默囊胚時(shí)期特異性表達(dá)的多能性標(biāo)記基因，接近體內(nèi)胚胎的2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期（圖1）。其次他們發(fā)現(xiàn)撤去PlaB后，TBLCs細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)換到多能性狀態(tài)（圖1），說(shuō)明單個(gè)剪接抑制劑PlaB可以操縱這個(gè)多能/全能干細(xì)胞轉(zhuǎn)換過(guò)程。SLP培養(yǎng)條件提供了一個(gè)可靠的體外系統(tǒng)來(lái)研究全能到多能細(xì)胞的轉(zhuǎn)換，且這個(gè)系統(tǒng)在分子水平上能夠模擬從體內(nèi)2細(xì)胞時(shí)期到囊胚時(shí)期的發(fā)育。
圖1 TBLC轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)定，且接近體內(nèi)2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期胚胎
2、TBLC在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、翻譯組、DNA甲基化組和染色質(zhì)可及性上具有與2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期相似的分子特征
作者首先對(duì)PSCs和TBLCs進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。使用23個(gè)多能性標(biāo)記基因和30個(gè)全能性基因以及轉(zhuǎn)座子Mervl和Mt2，區(qū)分了PSC和TBLC，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的TBLC來(lái)自SLP培養(yǎng)基，說(shuō)明SLP培養(yǎng)基能培養(yǎng)和維持TBLC細(xì)胞的同質(zhì)性（圖2）。此外，翻譯組測(cè)序（Ribosomal profiling，Ribo- seq）顯示，與PSCs相比，TBLCs在翻譯組水平上全能性基因表達(dá)上調(diào)，多能性標(biāo)記基因表達(dá)下調(diào)。作者使用全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序法（Whole-Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）來(lái)表征PSCs和TBLCs的DNA甲基化組，發(fā)現(xiàn)PSCs中的整體甲基化水平為71%，接近E6.5-E7.5時(shí)期胚胎；而TBLCs與之相比甲基化水平大幅降低至35%，類似于體內(nèi)2細(xì)胞和4細(xì)胞胚胎（整體甲基化程度分別為47%和41%）。染色質(zhì)可及性測(cè)序ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）結(jié)果顯示，與PSCs相比，TBLCs在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近的開放峰和封閉峰與小鼠2細(xì)胞和4細(xì)胞胚胎時(shí)期顯示出相似的開放或封閉狀態(tài)，這意味著TBLCs具有與早期胚胎相似的染色質(zhì)可及性。綜上,作者使用單細(xì)胞測(cè)序以及多組學(xué)分析，表征了與體內(nèi)全能性胚胎相似的TBLCs在轉(zhuǎn)錄組，DNA甲基化組，染色質(zhì)可及性和翻譯組上的分子特征。
圖2 SLP培養(yǎng)基能培養(yǎng)和維持TBLC細(xì)胞的同質(zhì)性
3、TBLC與EPSCs和2C-like細(xì)胞不同，在分子水平上靠近2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期胚胎
此外，作者比較了TBLCs與已發(fā)表的EPSCs和2C-like細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與TBLCs細(xì)胞中大多數(shù)多能性標(biāo)記基因被廣泛沉默不同，EPSCs仍明顯表達(dá)多能性標(biāo)記基因；而在TBLCs中高表達(dá)的全能性基因或轉(zhuǎn)座子在EPSCs中表達(dá)量很低。最后，作者對(duì)TBLCs和EPSCs與小鼠植入前胚胎數(shù)據(jù)進(jìn)行了基于轉(zhuǎn)錄組的主成分分析以及與2C-like細(xì)胞的相關(guān)性分析（圖3），發(fā)現(xiàn)TBLCs明顯靠近2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期胚胎，EPSCs和2C-like細(xì)胞接近多能性囊胚時(shí)期，這與最近一個(gè)研究組得到的結(jié)論一致[4]。
圖3 TBLC與EPSC和2C-like細(xì)胞不同，更接近2細(xì)胞和4細(xì)胞時(shí)期胚胎
4、TBLC具有雙向分化潛能，能夠產(chǎn)生多種胚內(nèi)和胚外細(xì)胞譜系
作者進(jìn)行的功能嵌合實(shí)驗(yàn)表明，TBLC具有強(qiáng)大的雙向發(fā)育潛能，可以產(chǎn)生胚內(nèi)和胚外組織，包括囊胚時(shí)期的TE，E6.5-E7.5胚胎的EPC和ExE，以及發(fā)育后期的胎盤和卵黃囊。更重要的是，作者還觀察到來(lái)源于單個(gè)TBLC的熒光標(biāo)記細(xì)胞可以嵌合進(jìn)入整個(gè)E6.5-E7.5胚胎，包括EPI，ExE和EPC（圖4）。小鼠胎盤是一個(gè)富含血液的復(fù)雜器官，為了避免免疫染色產(chǎn)生的假陽(yáng)性，作者將E13.5嵌合小鼠的胎盤和卵黃囊消化成單細(xì)胞，并通過(guò)流式富集篩選出有熒光標(biāo)記的TBLC來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其能夠在小鼠體內(nèi)分化為至少6種胚外和15種胚內(nèi)細(xì)胞類型。本篇文章首次利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組準(zhǔn)確追蹤出供體細(xì)胞的發(fā)育譜系，為全能性細(xì)胞的功能性檢驗(yàn)提供了一個(gè)更嚴(yán)格的檢驗(yàn)方法。作者使用單細(xì)胞測(cè)序，證明了TBLC能夠在胎盤和卵黃囊中分化為至少6種胚外和15種胚內(nèi)細(xì)胞類型（圖5）。
圖4 TBLC在E6.5-E7.5的嵌合胚胎中能分化到胚內(nèi)和胚外組織
圖5 單細(xì)胞水平上鑒定TBLCs能夠分化到多個(gè)胚內(nèi)和胚外細(xì)胞譜系
最后，作者發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎干細(xì)胞中，動(dòng)態(tài)剪接體阻遏導(dǎo)致了廣泛的內(nèi)含子積累，從而導(dǎo)致多能性基因表達(dá)下降，而全能性基因仍然可以被有效地剪接并激活，這可能與全能性基因擁有短而少的內(nèi)含子的獨(dú)特基因特征有關(guān)，但是更詳細(xì)的機(jī)制還需要繼續(xù)探索。
綜上，此項(xiàng)研究首次建立了體外捕獲和培養(yǎng)全能性干細(xì)胞的方法，而且令人驚奇的揭示了剪接體在干細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變中的重要決定作用。故此，該成果不但對(duì)于早期胚胎發(fā)育相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了新的體外研究體系，同時(shí)也為未來(lái)干細(xì)胞相關(guān)的臨床醫(yī)學(xué)研究提供了新型的發(fā)育潛能極高的“種子細(xì)胞”來(lái)源。
北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的杜鵬研究員為該論文的通訊作者。北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院博士研究生申輝，生命科學(xué)學(xué)院博士研究生楊敏和前沿交叉學(xué)科研究院博士研究生李詩(shī)雨為本文的并列第一作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張靜、常在，北京大學(xué)博士研究生彭冰、汪春暉和博士后翁健莉對(duì)本文有重要貢獻(xiàn)。該項(xiàng)目得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、北京大學(xué)“細(xì)胞增殖與分化”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.020
博士后招聘：
北京大學(xué)杜鵬實(shí)驗(yàn)室依托于北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心，從事RNA調(diào)控，干細(xì)胞及腫瘤生物學(xué)的相關(guān)研究。主要致力于分析和鑒定未知的RNA調(diào)控通路，并研究相關(guān)RNA調(diào)控通路在胚胎干細(xì)胞的分化命運(yùn)決定和早期胚胎發(fā)育中的功能。同時(shí)也嘗試于在動(dòng)物細(xì)胞中重組植物或微生物中特異的RNA調(diào)控通路，并研究其潛在的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用?，F(xiàn)誠(chéng)聘博士后2-3名。詳細(xì)信息請(qǐng)見(jiàn)鏈接：http://www.bio.pku.edu.cn/homes/Index/news_cont/37/15569.html
參考文獻(xiàn)：
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