Nature | 杜鵬課題組與合作者揭示胚層分化過程中的全局miRNA劑量控制機(jī)制
miRNA是真核生物中廣泛存在的長約21到23個核苷酸的小核糖核酸分子，它們無法翻譯成蛋白質(zhì)，但是可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。Microprocessor復(fù)合物（微處理器復(fù)合物）主要由一個DROSHA和兩個DGCR8蛋白組成，可以將pri-miRNA加工切割成大約70~90個堿基的pre-miRNA，是動物細(xì)胞miRNA生物發(fā)生過程中所必需的。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)，位于DGCR8 mRNA 5’ 末端的莖環(huán)(stem loop, SL)可以被Microprocessor切割，作為Microprocessor表達(dá)的自我調(diào)節(jié)機(jī)制中的一環(huán)?[1, 2]。然而，相關(guān)的分子功能和生物學(xué)相關(guān)性尚不清楚。miRNA在胚胎發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用，其失調(diào)也會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。在不同的組織和腫瘤中觀察到miRNA整體表達(dá)量的差異，這表明精確的miRNA劑量控制在腫瘤發(fā)生和生物體發(fā)育中都發(fā)揮重要作用 [3-6]，但是其調(diào)控的潛在機(jī)制仍不清楚。
2021年5月5日，哈佛大學(xué)Richard I. Gregory與生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京大學(xué)杜鵬課題組在Nature雜志在線發(fā)表了題為“Global miRNA dosage control of embryonic germ layer specification”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)換DGCR8不同的啟動子，可以使Microprocessor在可溶狀態(tài)和聚集狀態(tài)中保持平衡，從而精確地控制全局的miRNA劑量，并在早期胚胎發(fā)育中影響胚層的分化過程。
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在本研究工作中，作者主要有以下發(fā)現(xiàn)：
1、DGCR8 mRNA存在跳過第一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的選擇性轉(zhuǎn)錄
通過分析RNA-seq數(shù)據(jù)，作者意外地發(fā)現(xiàn)了一個沒有第一個外顯子的DGCR8 mRNA的短亞型，該亞型在小鼠胚胎干細(xì)胞 (mouse embryonic stem cell, mESC)向擬胚體(embryoid body, EB)分化的第4天首次出現(xiàn)，與兩個預(yù)測的可變啟動子位置相符。5’ RACE (5’ Rapid Amplification of cDNA End) 實驗也證明mESC中DGCR8 mRNA的5’ 末端主要是已注釋的類型，然而在EB細(xì)胞中（第13天）約有一半的5’ 末端是跳過第一個莖環(huán)結(jié)構(gòu) (SL1) 的短亞型（圖1）。由此得知DGCR8在mESC分化過程中存在選擇性轉(zhuǎn)錄起始（alternative transcription initiation, ATI）。
圖1 DGCR8在小鼠胚胎干細(xì)胞分化過程中存在選擇性轉(zhuǎn)錄
作者推測由ATI引起的SL1跳躍性可能會影響Microprocessor的自我調(diào)節(jié)機(jī)制。為了驗證這一點，他們構(gòu)建了ΔSL1細(xì)胞系。與WT細(xì)胞相比，ΔSL1細(xì)胞中DGCR8和DROSHA蛋白均有顯著積累。 然而DGCR8蛋白的積累量是DROSHA蛋白的3倍，導(dǎo)致DGCR8蛋白過量，蛋白比例失調(diào)。結(jié)合其他實驗結(jié)果可以得知，位于5’ UTR的SL1負(fù)責(zé)Microprocessor的自我調(diào)節(jié)，以保持精確的DGCR8:DROSHA化學(xué)計量。
2、過量的DGCR8蛋白導(dǎo)致Microprocessor發(fā)生不可逆的相變
由于大分子的相分離影響各種生化反應(yīng) [7, 8] ，并且化學(xué)計量對生物分子凝聚物的形成很重要 [9]，作者接下來探討了Microprocessor可能存在的相分離現(xiàn)象。作者發(fā)現(xiàn), Microprocessor在ΔSL1細(xì)胞中形成了許多明顯分離的不可逆的puncta, 但WT細(xì)胞中沒有。接下來作者進(jìn)一步在體外驗證了Microprocessor的相分離現(xiàn)象。由于結(jié)構(gòu)研究表明一個Microprocessor由兩個DGCR8和一個DROSHA蛋白構(gòu)成，作者將rDRCG8和rDROSHA先以2:1的比例混合，沒有檢測到明顯的相分離。而在DGCR8:DROSHA比值為4:1和6:1的混合物中，出現(xiàn)了許多明顯的Microprocessor不可逆的聚集。綜上所述，受調(diào)控的DGCR8:DROSHA化學(xué)計量比對于維持Microprocessor的可溶性是重要的，但轉(zhuǎn)錄后自我調(diào)節(jié)機(jī)制的破壞導(dǎo)致DGCR8:DROSHA化學(xué)計量失衡，直接導(dǎo)致Microprocessor形成缺乏流動性的不可逆聚集（圖2）。
圖2 DGCR8: DROSHA化學(xué)劑量失衡導(dǎo)致發(fā)生不可逆的相分離
3、?miRNA劑量控制機(jī)制——選擇性轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的Microprocessor自我調(diào)節(jié)機(jī)制
為了進(jìn)一步探究Microprocessor不可逆的聚集對其功能的影響，作者進(jìn)行了切割活性實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過量的rDGCR8蛋白(4:1和6:1)抑制了Microprocessor對pri-miRNA的切割。使用從WT和ΔSL1細(xì)胞制備的細(xì)胞裂解液進(jìn)行的體外切割實驗也表明，與WT細(xì)胞相比，來自ΔSL1的細(xì)胞裂解液對pri-miRNA的切割活性降低。以上數(shù)據(jù)表明Microprocessor的聚集抑制了其對pri-miRNA的加工處理能力。此外，與WT細(xì)胞相比，ΔSL1細(xì)胞中整體miRNA表達(dá)普遍減少，但并非完全丟失。綜上所述，DGCR8 mRNA 5' UTR中的第一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)是維持精確的DGCR8：DROSHA化學(xué)計量比所必需的，這對于避免Microprocessor的聚集以維持miRNA的加工效率和正常豐度是必不可少的。作者將這種由選擇性轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的Microprocessor自我調(diào)節(jié)機(jī)制叫做“?miRNA劑量控制”機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與WT細(xì)胞相比，ΔSL1細(xì)胞中的差異表達(dá)基因以上調(diào)為主，這與其miRNA整體表達(dá)量減少是一致的。GO分析顯示，這些基因在“脂質(zhì)代謝過程”中富集。因此，miRNA劑量的整體減少解除了對胚胎干細(xì)胞中脂質(zhì)代謝基因的抑制（圖3）。
圖3 Microprocessor聚集降低了miRNA加工效率和整體含量，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝基因上調(diào)
4、?miRNA劑量控制影響胚層分化
由于DGCR8的ATI介導(dǎo)的miRNA劑量控制在EB分化4天后開始出現(xiàn)，作者推測該機(jī)制可能影響了后期發(fā)育階段的細(xì)胞命運決定。分析發(fā)現(xiàn)，ATI引起的DGCR8短亞型主要在內(nèi)胚層細(xì)胞中檢測到，而不在外/中胚層或EpiSC中 [10]。對WT和ΔSL1細(xì)胞進(jìn)行的神經(jīng)祖細(xì)胞(外胚層)或EB分化的轉(zhuǎn)錄組均顯示，SL1缺失導(dǎo)致的miRNA劑量控制的缺失顯著抑制了干細(xì)胞向外胚層和中胚層的分化。通過小鼠畸胎瘤實驗，作者觀察到來自ΔSL1細(xì)胞的畸胎瘤與來自WT細(xì)胞的畸胎瘤相比，其大小和重量顯著減少，這意味著miRNA劑量控制的缺失導(dǎo)致了發(fā)育缺陷。對畸胎瘤切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫熒光分析也表明，與WT細(xì)胞相比，ΔSL1細(xì)胞生成的內(nèi)胚層組織相對較多。此外，使用脂質(zhì)代謝小分子抑制劑?(GW9662)?處理分化的EB細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抑制脂質(zhì)代謝會抑制胚胎干細(xì)胞向內(nèi)胚層的命運轉(zhuǎn)變，但促進(jìn)向中胚層的發(fā)育。總的來說，以上數(shù)據(jù)表明ATI介導(dǎo)的miRNA劑量控制機(jī)制可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來影響胚層分化（圖4）。
圖4 ATI介導(dǎo)的miRNA劑量控制機(jī)制影響胚層分化
5、?miRNA劑量控制機(jī)制在人類中同樣是保守的
由于SL1介導(dǎo)的Microprocessor自我調(diào)節(jié)在小鼠和人之間是保守的 [1,2]，作者在人類細(xì)胞中進(jìn)一步探索了上述機(jī)制。在不同的人類細(xì)胞系中，作者發(fā)現(xiàn)在?HepG2和K562細(xì)胞系中出現(xiàn)了DGCR8的短亞型，并且與預(yù)測的DGCR8 mRNA 5’ UTR處接近SL1結(jié)構(gòu)的一個轉(zhuǎn)錄起始位點非常吻合，5’ RACE實驗也證實了這點。在這兩個細(xì)胞系中，也發(fā)現(xiàn)了Microprocessor的不可逆聚集和miRNA的整體表達(dá)量降低。此外，作者在H1299細(xì)胞中敲除SL1，得到了與小鼠細(xì)胞相同的結(jié)果。最后，通過分析來自GTEX數(shù)據(jù)集的RNA-seq數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)某些組織中有潛在的DGCR8的ATI存在，有趣的是這些組織通常來源于胚胎內(nèi)胚層，包括肝臟、甲狀腺、胃和胰腺等，這與作者提出的模型吻合。因此，miRNA的劑量控制機(jī)制在人類細(xì)胞和組織中同樣是保守的（圖5）。
圖5 ATI介導(dǎo)的miRNA劑量控制機(jī)制在人類細(xì)胞和組織中是保守的
miRNA作為轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的一個不可或缺的層面，在腫瘤發(fā)生和發(fā)育過程中都起著至關(guān)重要的作用，越來越多的證據(jù)支持精確的全局miRNA劑量控制在這些背景下是非常重要的。本研究表明，內(nèi)源性miRNA的劑量控制是由DGCR8啟動子轉(zhuǎn)換介導(dǎo)的，DGCR8啟動子的轉(zhuǎn)換平衡了Microprocessor可溶和聚集狀態(tài)，從而控制整體miRNA的表達(dá)，影響干細(xì)胞胚層分化過程中的命運決定。
哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Richard I. Gregory教授與北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生命科學(xué)聯(lián)合中心的杜鵬研究員為該論文的共同通訊作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生崔英姿和前沿交叉學(xué)科研究院博士研究生呂學(xué)暉為本文的并列第一作者。北京大學(xué)高歌教授及其學(xué)生柯嵐（已畢業(yè)）、楊德昌參與了部分工作，北京大學(xué)博士研究生丁力、齊燁和博士后翁健莉等對本文有重要貢獻(xiàn)。韓國國立首爾大學(xué)Narry Kim教授，清華大學(xué)李丕龍研究員、戚益軍教授，美國加州大學(xué)圣地亞哥分校付向東教授對本課題提出了重要建議。該項目得到了國家自然科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、北京大學(xué)“細(xì)胞增殖與分化”教育部重點實驗室、生命科學(xué)聯(lián)合中心以及美國國家綜合醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所（NIGMS）的資助。
原文鏈接：https://dx.doi.org/10.1038/s41586-021-03524-0
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參考文獻(xiàn)：
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