蔣爭凡課題組發(fā)現(xiàn)STING活化所需共配體
cGAS是胞質(zhì)內(nèi)雙鏈DNA或Mn2+?的受體，也是一個二核苷酸環(huán)化酶，被DNA和/或Mn2+?激活后利用細(xì)胞質(zhì)中的ATP和GTP合成第二信使2’3’-cGAMP?，后者進(jìn)一步激活STING，最終介導(dǎo)抗病毒/腫瘤免疫反應(yīng)。而Mn2+?激活的cGAS以一種更高效路徑合成2’3’-cGAMP，Mn2+?單獨(dú)使用或與PD-1抗體聯(lián)合使用（錳免療法）可顯著增強(qiáng)腫瘤治療效果。cGAMP與STING結(jié)合后，STING需要從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體才能夠被活化。但為什么STING活化必需從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)位至高爾基體一直是領(lǐng)域內(nèi)懸而未決的重要科學(xué)問題。已有的研究表明STING的轉(zhuǎn)位和激活緊密偶聯(lián)：阻斷膜泡運(yùn)輸?shù)囊种苿〣FA可完全阻斷STING的激活，而STING的自激活突變體則會自發(fā)的定位于高爾基體。更加有趣的發(fā)現(xiàn)來源于最近關(guān)于COPA綜合征的自身免疫疾病的研究。COPA是負(fù)責(zé)蛋白從高爾基體向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收的COPI復(fù)合體的關(guān)鍵亞基，其突變會導(dǎo)致逃逸到高爾基體的STING無法向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)回收，從而使STING在高爾基體累積并自激活，引發(fā)自身免疫疾病。攜帶COPA突變的細(xì)胞中STING的活化完全不依賴于cGAMP，說明定位于高爾基體的STING可自發(fā)活化，并提示高爾基體中存在STING活化所需的未知配體。
?
細(xì)胞間存在由細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)和多糖構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)。胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞提供支架，還對細(xì)胞存活、發(fā)育、遷移、增殖等有重要調(diào)控作用。粘多糖是一類在高爾基體合成的、由二糖重復(fù)單元構(gòu)成的直鏈線性聚合物，其主要成分硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycans，sGAGs）是胞外基質(zhì)的重要成員，也是骨基質(zhì)和結(jié)締組織的主要成分。基于二糖單元的不同組成，可將硫酸化糖胺聚糖分為四大類：①硫酸皮膚素（dermatin sulfate，DS）；②硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）；③硫酸角質(zhì)素（keratan sulfate，KS）；④硫酸類肝素（heparan sulfate，HS）和肝素（heparin，Hp）。硫酸化糖胺聚糖廣泛分布于細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞表面或胞內(nèi)膜泡（高爾基體、內(nèi)體及分泌小泡）。由于荷載大量帶負(fù)電的硫酸化修飾，細(xì)胞外硫酸化糖胺聚糖和靶蛋白上正電或極性氨基酸殘基結(jié)合，影響受體蛋白與其配體的相互作用或誘導(dǎo)受體寡聚，也被認(rèn)為是一些膜受體的共配體。近年來的研究發(fā)現(xiàn)粘多糖具有抗凝血、降血脂、抗病毒、抗腫瘤及抗放射等多種藥理活性作用。此外，粘多糖是動物藥的活性成分之一，常見于皮（阿膠、海參、蟬蛻、蛇蛻等），骨（虎骨、狗骨等），角（犀角、鹿茸等），鱗甲（穿山甲、龜板、鱉甲、玳瑁等）及粘液（蝸牛、泥鰍等）等藥材中，這些藥材是我國數(shù)千年傳統(tǒng)醫(yī)藥文化的瑰寶。已有的研究表明胞外硫酸化糖胺聚糖在調(diào)控很多種生理學(xué)功能方面發(fā)揮重要的作用，但胞內(nèi)硫酸化糖胺聚糖的生理學(xué)功能知之甚少，它們參與天然免疫反應(yīng)的功能從未見報道。
?
? 2021年4月14日，生命中心蔣爭凡實驗室在《Immunity》上以research article形式在線發(fā)表了STING為什么需要進(jìn)行高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制研究“Golgi-synthesized sulfated glycosaminoglycans mediate polymerization and activation of the cGAMP sensor STING”，報道高爾基體內(nèi)合成的硫酸化糖胺聚糖作為STING共配體介導(dǎo)STING在高爾基體的活化。在本研究中，蔣爭凡實驗室的方潤博士和蔣啟飛同學(xué)巧妙地利用了STING自激活突變體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的特性，在二倍體細(xì)胞HT1080中進(jìn)行了基于CRISPR–Cas9介導(dǎo)的全基因組篩選，發(fā)現(xiàn)多個參與硫酸化糖胺聚糖合成的關(guān)鍵基因被高度富集（圖1）。這些粘多糖合成關(guān)鍵基因的敲除使細(xì)胞喪失了對STING的反應(yīng)性。隨后，他們通過在不同細(xì)胞中構(gòu)建基因敲除細(xì)胞株，進(jìn)一步證明在高爾基體內(nèi)發(fā)生的硫酸化糖胺聚糖缺失會嚴(yán)重削弱cGAS-STING通路的激活。為了研究硫酸化糖胺聚糖是否直接作用于STING，他們選用了荷載硫酸化糖胺聚糖的核心蛋白SRGN作為硫酸化糖胺聚糖的指針，發(fā)現(xiàn)STING和SRGN存在DNA病毒誘導(dǎo)的共定位和相互作用（圖2A）。用攜帶肝素的磁珠進(jìn)行體外pull-down實驗也表明STING和肝素存在直接的相互作用，且結(jié)合cGAMP的STING具有更強(qiáng)的肝素結(jié)合能力（圖2B）。硫酸化糖胺聚糖由于荷載大量帶負(fù)電的硫酸化修飾，因而主要通過靜電相互作用與靶蛋白上的正電氨基酸殘基結(jié)合來發(fā)揮功能。由于胞內(nèi)硫酸化糖胺聚糖存在于高爾基體腔內(nèi)，他們推測位于STING第一和第二跨膜區(qū)之間的三個正電氨基酸殘基（H42，R45，H50）可能參與結(jié)合硫酸化糖胺聚糖（圖2C）。將這三個正電氨基酸進(jìn)行突變會顯著削弱STING的激活（圖2D）。進(jìn)一步將位于STING第一和第二跨膜區(qū)及第三和第四跨膜區(qū)內(nèi)的極性氨基酸進(jìn)行突變則會使STING的活性逐步降低直至完全消失。有意思的是，回復(fù)上述三個正電氨基酸中的任意一個都可使完全沒有活性的突變體恢復(fù)部分功能。將42位或50位回復(fù)為電性更強(qiáng)的賴氨酸或精氨酸，STING的活性會隨著回復(fù)的氨基酸的正電荷增多而逐漸增強(qiáng)。有意思的是，在不含有正電氨基酸的第三和第四跨膜區(qū)引入正電氨基酸（P110R）也會部分回復(fù)突變STING的活性。免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)各種STING突變體與SRGN的相互作用強(qiáng)度和這些突變體的活性有非常一致的相關(guān)性；更重要的是，通過引入額外的帶正電的精氨酸（Y46R/H50R，H50R/P110R等）則會使STING組成性地結(jié)合硫酸化糖胺聚糖而發(fā)生自激活（圖2E）。這些結(jié)果表明硫酸化糖胺聚糖和STING的結(jié)合能力是決定STING能否激活及激活強(qiáng)度的決定因素之一。
?
?
為了進(jìn)一步研究硫酸化糖胺聚糖如何介導(dǎo)STING的激活，他們通過體外實驗發(fā)現(xiàn)多種硫酸化糖胺聚糖可不同程度地誘導(dǎo)STING全長蛋白發(fā)生多聚體化并誘導(dǎo)激酶TBK1的活化，其中硫酸肝素（HS）和肝素（Hp）的激活效果最佳（圖2E）。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)硫酸化糖胺聚糖激活STING是糖鏈長度依賴的，最短由四個單糖形成的糖鏈即具有激活STING的能力，并且這種激活依賴于糖鏈上的O-位硫酸化修飾。更為重要的是，通過對人、小鼠、蝙蝠和雞四種來源的STING進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，硫酸化糖胺聚糖介導(dǎo)STING激活的機(jī)制在進(jìn)化上是高度保守的。最后，他們通過小鼠實驗表明硫酸化糖胺聚糖的合成對于小鼠抵抗DNA病毒感染十分關(guān)鍵。
綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)：1）STING活化需要兩種配體。第一種配體是環(huán)化二核苷酸（其中2’3’-cGAMP結(jié)合能力最強(qiáng)），與STING細(xì)胞質(zhì)一側(cè)的環(huán)化二核苷酸結(jié)合區(qū)域結(jié)合并導(dǎo)致STING轉(zhuǎn)位至高爾基體；第二種配體為本研究發(fā)現(xiàn)的高爾基體內(nèi)sGAGs，與STING高爾基體內(nèi)一側(cè)的正電荷（極性）氨基酸結(jié)合，像鉸鏈一樣引發(fā)STING多聚化，進(jìn)而招募并促進(jìn)TBK1自磷酸化及下游通路活化（圖3）。2）揭開了“為什么STING必需去高爾基體活化”這一重要的科學(xué)謎題，有望打通STING活化的“最后一公里”。3）填補(bǔ)了胞內(nèi)硫酸化糖胺聚糖的生理學(xué)功能研究的空白，揭示了生物多糖在細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵免疫學(xué)功能，為未來生物多糖在抗病毒、抗腫瘤的臨床實踐提供新的線索。
北京大學(xué)生科院博士后方潤和2015級PTN項目博士生蔣啟飛為該文章的共同第一作者，生命中心/生科院的蔣爭凡為通訊作者。本研究工作得到了生命科學(xué)聯(lián)合中心、國家自然科學(xué)基金委、科技部國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項目及北京大學(xué)“細(xì)胞增殖與分化”教育部重點(diǎn)實驗室的資助。
?
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.03.011
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實其真實性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請聯(lián)系我們及時修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com