蔣爭凡實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)“STING相分離器”調(diào)節(jié)天然免疫
細(xì)胞內(nèi)有許多無膜包被的生物分子凝集體，能為一系列生化反應(yīng)提供特定的空間，如蛋白-RNA組成的核仁、DNA損傷修復(fù)區(qū)域、應(yīng)激顆粒等。目前的研究表明大多數(shù)的凝集體由生物分子通過相分離形成。生物凝集體擁有獨(dú)特的物化性質(zhì)，在生化反應(yīng)速率、特異性、膜泡融合及不同細(xì)胞器間物質(zhì)運(yùn)輸和貯藏等方面發(fā)揮重要功能。目前蛋白質(zhì)相分離的研究大多集中在可溶性蛋白，或者與膜蛋白結(jié)合的可溶性蛋白，跨膜蛋白相分離形成細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)鮮有報(bào)道。
立方膜結(jié)構(gòu)是哥倫比亞大學(xué)Pappas和Brandt于1959年在變形蟲細(xì)胞中最先發(fā)現(xiàn)的、由線粒體膜形成的三維周期性立方相膜結(jié)構(gòu)。此后60多年有數(shù)百篇研究論文報(bào)道類似的立方膜結(jié)構(gòu)幾乎存在于所有生命體的各種細(xì)胞中，并且可從任何一種細(xì)胞膜變化而來。如藍(lán)藻光合類囊體膜形成“螺旋狀晶格”膜結(jié)構(gòu)、植物韌皮部中結(jié)構(gòu)相同但晶格不同的兩種立方膜結(jié)構(gòu)。動(dòng)物細(xì)胞中，立方膜經(jīng)常出現(xiàn)在病理（感染、腫瘤及自身免疫?。l件下，如病原微生物感染誘導(dǎo)不同的細(xì)胞器膜形成立方膜，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的立方膜結(jié)構(gòu)長期被作為乙肝病毒HBV或艾滋病毒HIV感染的病理學(xué)標(biāo)志（兩類病毒都激活cGAS-STING通路），比如絕大多數(shù)艾滋病患者的淋巴細(xì)胞具有獨(dú)特的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)立方膜。然而，至今為止，人們對(duì)這些奇異膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的原因和功能幾乎一無所知。與此相關(guān)的奇特現(xiàn)象是：由于該類結(jié)構(gòu)被不同研究者在不同細(xì)胞的不同細(xì)胞器膜發(fā)現(xiàn)，它們的起因和功能又都未知，因此這類膜結(jié)構(gòu)有超過130種不同的命名。
cGAS是胞質(zhì)內(nèi)雙鏈DNA或Mn2+?受體，它是一個(gè)二核苷酸環(huán)化酶。被DNA和/或Mn2+?激活的cGAS合成第二信使2’3’-cGAMP，后者進(jìn)一步激活STING（MITA/ERIS），最終激活機(jī)體的抗病毒/抗腫瘤天然免疫反應(yīng)；而Mn2+?單獨(dú)激活的cGAS以一種更高效的路徑合成2’3’-cGAMP。STING是分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的4次跨膜蛋白，與2’3’-cGAMP結(jié)合后需要發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)，離開內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)高爾基體，最后到高爾基體來源的小膜泡上（稱之為STING translocators）；而為什么STING必需去高爾基體活化這個(gè)問題一直很不清楚。最近北京大學(xué)蔣爭凡實(shí)驗(yàn)室通過基于STING過度活化導(dǎo)致細(xì)胞死亡而進(jìn)行的全基因組CRISPR/Cas9篩選，發(fā)現(xiàn)STING的活化需要兩種配體：1）細(xì)胞質(zhì)里的環(huán)化二核苷酸（如2’3’-cGAMP），2）高爾基體內(nèi)的硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）。前者誘導(dǎo)STING轉(zhuǎn)移到高爾基體，后者導(dǎo)致STING多聚化，招募并激活TBK1。sGAGs與STING結(jié)合后，像鉸鏈一樣引發(fā)STING發(fā)生多聚化，進(jìn)而招募并促進(jìn)TBK1的自磷酸化及下游通路活化（Fang et al., 2021,?Immunity）。重要的是，cGAS也會(huì)被泄露到細(xì)胞質(zhì)的自身DNA或細(xì)胞內(nèi)累積的Mn2+激活，在抗腫瘤免疫，自身免疫病，細(xì)胞損傷及衰老等過程中發(fā)揮重要作用。Mn2+?和PD-1抗體聯(lián)合使用的“錳免療法”可顯著增強(qiáng)PD-1抗體的腫瘤治療效果。類似Mn2+?通過激活cGAS-STING通路促進(jìn)腫瘤治療的方法也被國內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室所發(fā)現(xiàn)或證實(shí)。
目前，蛋白質(zhì)相分離參與天然免疫調(diào)節(jié)的研究剛剛開始，僅有的兩個(gè)報(bào)道是發(fā)現(xiàn)了cGAS與DNA結(jié)合后發(fā)生二聚化/寡聚化并導(dǎo)致cGAS蛋白的相分離，其中鋅離子（Zn2+）是一個(gè)重要的促進(jìn)因子。2021年4月8日，生命中心蔣爭凡實(shí)驗(yàn)室在《Nature Cell Biology》上以Research Article形式在線發(fā)表了他們?cè)谔烊幻庖呒暗鞍踪|(zhì)相分離領(lǐng)域的最新研究成果—The STING Phase-Separator Suppresses Innate Immune Signaling。
本研究工作中，蔣爭凡實(shí)驗(yàn)室的于曉彧同學(xué)首先發(fā)現(xiàn)在DNA病毒感染后期的細(xì)胞內(nèi)，或體外用STING激活劑（2’3’-cGAMP、c-di-GMP）處理的細(xì)胞內(nèi)，均可觀察到未進(jìn)行高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的STING蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成不少有高度液滴性質(zhì)的微米級(jí)別的凝集體。熒光漂白技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)STING形成的凝集體非常類似于可溶性蛋白發(fā)生液相-液相分離形成的相分離液滴。更令人驚奇的是，光鏡-電鏡聯(lián)合技術(shù)并結(jié)合免疫電鏡顯示STING蛋白形成的凝集體是一個(gè)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成的、高度特化的內(nèi)部像拼圖樣（Puzzle-like）的膜結(jié)構(gòu)；三維重組后的結(jié)果則顯示在細(xì)胞核周圍形成“蜂窩狀”的“類細(xì)胞器”樣結(jié)構(gòu)，非常類似于艾滋病患者淋巴細(xì)胞中廣泛存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)“立方膜結(jié)構(gòu)”（圖1）。STING-APEX標(biāo)記、染色的電鏡下呈現(xiàn)的STING相分離膜結(jié)構(gòu)中充滿了密布STING的、由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡堆疊、擠壓形成的“單位膜”；而電鏡下STING translocators則顯著不同，APEX染色顯示為直徑100 nm左右的小膜泡，STING非常密集地分布于膜泡外周。他們利用純化的STING全長蛋白在體外重建了相分離體系，并進(jìn)行了一系列的機(jī)制研究：發(fā)現(xiàn)超過一定閾值的2’3’-cGAMP可強(qiáng)烈誘導(dǎo)STING蛋白發(fā)生相分離；而Mn2+?可顯著降低所需的2’3’-cGAMP濃度，Mg2+?或Zn2+?則無此作用。有趣的是，體外重建獲得的STING相分離液滴具有類似細(xì)胞內(nèi)立方膜但又不同的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征（圖2）。細(xì)胞質(zhì)中，病毒感染后活化的cGAS持續(xù)性地產(chǎn)生并且累積2’3’-cGAMP，而目前尚沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)特異性降解2’3’-cGAMP的磷酸酯酶。這些結(jié)果提示：細(xì)胞內(nèi)適度水平的2’3’-cGAMP會(huì)誘導(dǎo)STING轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體并發(fā)生抗病毒天然免疫通路的活化；而在病毒感染后期，細(xì)胞內(nèi)過度累積的2’3’-cGAMP則能夠誘導(dǎo)留存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、沒有被活化的STING蛋白發(fā)生相分離。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示STING相分離產(chǎn)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜“立方膜結(jié)構(gòu)”可能通過在空間上將STING-TBK1與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF3進(jìn)行“隔離”，進(jìn)而負(fù)調(diào)節(jié)cGAS-STING通路。因此，這個(gè)由細(xì)胞內(nèi)高濃度2’3’-cGAMP觸發(fā)、Mn2+促進(jìn)、STING蛋白相分離形成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)立方膜結(jié)構(gòu)被命名為“STING相分離器”（The STING Phase -Separator），用于隔離細(xì)胞內(nèi)未激活的STING-TBK1（也包括與STING結(jié)合的2’3’-cGAMP），從而在另外一個(gè)層次保證天然免疫不會(huì)過度活化（圖3）。實(shí)際上，該內(nèi)質(zhì)網(wǎng)立方膜結(jié)構(gòu)的作用方式可能像一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的2’3’-cGAMP-STING-TBK1“海綿”，吸附并隔離天然免疫關(guān)鍵分子。這樣的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制還暗示細(xì)胞可能并不需要胞內(nèi)的特異性磷酸二酯酶來水解病毒感染后期細(xì)胞質(zhì)中過度累積的2’3’-cGAMP。
這些結(jié)果也提示60余年前發(fā)現(xiàn)的存在于幾乎所有生命體各種細(xì)胞內(nèi)的各類立方膜結(jié)構(gòu)的形成可能受相關(guān)跨膜蛋白相分離的驅(qū)動(dòng)；而由膜蛋白相分離形成的這類膜結(jié)構(gòu)是細(xì)胞正常生命活動(dòng)的一部分，并在多種生理、病理過程中扮演重要角色。因此，通過蛋白相分離的角度研究這些細(xì)胞內(nèi)獨(dú)特膜結(jié)構(gòu)的形成與生理學(xué)功能，尤其是病理學(xué)功能可能具有重要的理論及實(shí)際意義。
北京大學(xué)生科院2016級(jí)博士生于曉彧同學(xué)為論文的第一作者，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心/生科院的蔣爭凡教授為通訊作者。生科院2019級(jí)博士生張瀝元同學(xué)幫助了本項(xiàng)研究。本研究工作得到了“北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心”、國家自然科學(xué)基金委、科技部國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目及北京大學(xué)“細(xì)胞增殖與分化”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的資助。
原文鏈接：https://dx.doi.org/10.1038/s41556-021-00659-0
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