Nature Neuroscience | 李毓龍實驗室開發(fā)新型熒光探針實現(xiàn)在體5-羥色胺動態(tài)變化的精確檢測
5-羥色胺（5-HT）又稱血清素（serotonin），是一種重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT參與了進食、睡眠、學習記憶、情緒、社交等多種行為的調(diào)節(jié)，而外周的5-HT則對胃腸蠕動、血管收縮、血小板聚集等生理過程的調(diào)控至關重要。5-HT系統(tǒng)的失調(diào)與抑郁癥（depression）、創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder, PTSD）、物質(zhì)濫用及行為成癮等精神障礙緊密相關。氟西?。╢luoxetine，商品名百憂解）等選擇性5-HT再攝取抑制劑作為目前臨床上最常用的一類抗抑郁藥，具有抗抑郁和抗焦慮的雙重作用。由此可見，5-HT系統(tǒng)的生理作用和臨床價值均極為重要。
令人遺憾的是，我們對5-HT系統(tǒng)的生理功能及作用機制仍知之甚少，這極大地限制了精神病學精準靶向藥物的革新與應用。5-HT可在多個核團釋放，在體內(nèi)有超過10種受體，作用時程短至亞秒級，長至數(shù)天，系統(tǒng)錯綜復雜。近年來，領域內(nèi)學者在小鼠5-HT能神經(jīng)元的全腦投射描繪及對特定5-HT能神經(jīng)元在獎賞、懲罰、進食等過程中的活動記錄方面取得了一些突破。這些研究為解析5-HT系統(tǒng)的功能提供了重要信息。然而，諸多關鍵機制問題仍懸而未決。譬如，在不同行為中，5-HT如何被系統(tǒng)地釋放？5-HT在不同腦區(qū)有何動態(tài)差異？5-HT在生理和病理狀態(tài)下的釋放又有何不同？傳統(tǒng)的檢測5-HT的方法包括微透析法、快速掃描循環(huán)伏安法等，但它們受限于時間或空間分辨率的不足，以及在長時段的檢測過程中信號不夠穩(wěn)定，因此很難實現(xiàn)長時程對5-HT在體動態(tài)變化的靈敏檢測。因此，具有細胞特異性、高時空分辨率的5-HT動態(tài)解析工具的開發(fā)將為解決這些重要的科學問題提供強有力的工具。2021年4月5日，生命中心、北京大學李毓龍實驗室在Nature Neuroscience雜志在線發(fā)表了題為“A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics”的研究論文，報道了新型基因編碼的5-HT熒光探針的開發(fā)及其在多種模式生物中的成功應用。
李毓龍實驗室是新型神經(jīng)遞質(zhì)感受器研發(fā)領域的開拓者，近年來已自主研發(fā)乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、腺苷等神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)的高效熒光探針。上述探針已廣泛應用于神經(jīng)環(huán)路功能及相關信號分子釋放機制等領域的研究。沿用課題組近年來應用G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor, GPCR）構(gòu)建熒光探針的策略，李毓龍課題組將內(nèi)源性5-HT受體與循環(huán)重排的綠色熒光蛋白（circularly permutated green fluorescent protein, cpGFP）融合，通過一系列蛋白質(zhì)工程優(yōu)化，成功開發(fā)了新型G蛋白偶聯(lián)受體激活依賴的GRAB（GPCR-Activation-Based）5-HT熒光探針GRAB5-HT1.0。GRAB5-HT1.0在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元中對5-HT的熒光信號響應幅度接近300%，對5-HT分子具有高度的特異性及親和力，反應動力學速率可達亞秒級別（圖1）。
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圖1：新型5-HT熒光探針的刻畫。
（a）GRAB5-HT1.0和GRAB5-HTmut在神經(jīng)元中的表達以及對5-HT的熒光信號響應。（b）GRAB5-HT1.0在HEK細胞中的動力學特征。（c）GRAB5-HT1.0對5-HT的分子特異性。
? ? ?為探究GRAB5-HT1.0在不同模式生物中應用的普適性，研究者分別在果蠅和小鼠中對探針功能進行了檢測。GRAB5-HT1.0不但能夠在活體果蠅大腦中檢測到生理刺激所引起的單個神經(jīng)元的5-HT釋放，還可以結(jié)合光纖記錄系統(tǒng)，在自由活動的小鼠中實時檢測睡眠-覺醒過程中5-HT的動態(tài)變化。有意思的是，結(jié)合雙光子成像系統(tǒng)，GRAB5-HT1.0還能長時程在頭部固定的小鼠中檢測精神興奮類藥物引起的5-HT水平改變（圖2）。
圖2：新型5-HT探針的應用。
（a）GRAB5-HT1.0在果蠅蘑菇體的表達及對氣味、腹部電擊、外源5-HT的熒光信號響應。（b）GRAB5-HT1.0在自由活動小鼠中檢測內(nèi)源5-HT在睡眠覺醒過程中的動態(tài)變化。（b）GRAB5-HT1.0在頭部固定的小鼠中檢測精神興奮類藥物引起5-HT水平的變化。
新型5-HT熒光探針是進一步探究5-HT系統(tǒng)功能的重要工具，為解析大腦復雜神經(jīng)環(huán)路奠定了方法學基礎。同時，該工作也進一步證明課題組采用GPCR激活原理構(gòu)建熒光探針策略的普適性。我們期待在不久的將來能開發(fā)出更多針對不同重要信號分子的熒光探針，為精確解析神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)等重要分子功能開辟新的道路。
北京大學生命科學學院博士生萬金霞為第一作者，生命中心、北京大學生命科學學院李毓龍教授為通訊作者。北京大學博士生李雪霖、錢統(tǒng)瑞、曾健智、鄧飛等對文章做出了重要貢獻。該工作得到了中科院腦智技術(shù)卓越創(chuàng)新中心徐敏實驗室、北京腦科學與類腦研究中心井淼實驗室、美國弗吉尼亞大學J. Julius Zhu和B. Jill Venton實驗室等國內(nèi)外團隊的合作幫助，并得到北京大學膜生物學國家重點實驗室、國家自然科學基金、腦科學與類腦研究北方科學中心地方配套科研項目、生命科學聯(lián)合中心及美國腦計劃等機構(gòu)的大力支持。
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Jing Ren?(Group leader at MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)
Wan et al. presents a novel genetically encoded neurotransmitter sensor that can be used to image serotonin (5-HT) release, allowing neuroscientists to study the precise mechanisms of 5-HT signaling.
Mental illnesses affect more than 1 billion people globally. The serotonin (5-HT) system is the most frequently targeted neural system for treating mental illnesses, including depression and anxiety. Thus, understanding the 5-HT system is crucial for both basic and translational studies. However, the 5-HT system is extremely complicated across anatomical, physiological and behavioral levels, making it one of the most mysterious neural systems. It has brought enormous challenges to the study of its function and signaling mechanism. In order to understand when, where and how 5-HT is released during normal daily life and mental illness conditions, we need to “see” 5-HT in real-time and we need tools like genetically encoded neurotransmitter sensors to help us “see” it.
Genetically encoded neurotransmitter sensors are generally assembled from two components, a transmitter sensing domain and a reporter domain (e.g. fluorescent protein). This GRAB5-HT1.0?sensor developed in Prof. Yulong Li’s lab is one of their brilliant designs utilizing G-protein coupled receptors (GPCRs) as the sensing domains. It is based on the serotonin receptor HTR2C. GRAB5-HT1.0?was shown to detect serotonin in cultured cells, mouse brain slices, living fly and mouse brains. It is highly specific, exhibiting excellent sensitivity for measuring extracellular 5-HT dynamics. By using this sensor, Wan et al. finds that 5-HT levels change dynamically throughout the sleep–wake cycle in mice, indicating the wide applications for GRAB5-HT1.0?sensor in imaging 5-HT changes in the brains of live animals.
We expect that with innovative tools like GRAB5-HT1.0?and its upgrading versions, the relationships among the activity of 5-HT neurons, the release of 5-HT and its influences on the downstream neurons will be revealed soon. Hopefully, in the near future, these findings will help us to tackle the 5-HT system and we can finally understand the role of serotonin in the aetiology of mental illnesses.
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任婧?(英國MRC分子生物學實驗室課題組組長)
李毓龍團隊開發(fā)了一種新型可遺傳編碼的5-HT熒光探針，該探針使得神經(jīng)科學家們能夠精確地研究5-HT的信號通路。
全球范圍內(nèi)有超過10億人在遭受精神類疾病的折磨，而5-HT能系統(tǒng)是很多精神類疾病的治療靶點，包括抑郁癥和焦慮。因此，更好地了解5-HT能系統(tǒng)對于基礎研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究都至關重要。然而，5-HT能系統(tǒng)無論是在解剖結(jié)構(gòu)，還是在生理行為水平都非常復雜，這讓它成為最神秘的神經(jīng)系統(tǒng)之一。這也給5-HT能系統(tǒng)功能和信號通路的研究帶來了極大的挑戰(zhàn)。為了了解5-HT在生理和病理情況下是何時、何地以及如何被釋放地，我們需要實時地觀察5-HT的動態(tài)變化，而可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)探針可以幫助我們更好地觀測5-HT。
可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針通常包括兩個部分，即神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合域和熒光蛋白報告域。李毓龍教授實驗室開發(fā)的5-HT探針GRAB5-HT1.0是他們利用G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）作為神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合域開發(fā)探針的杰作之一。GRAB5-HT1.0探針的神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合域是5-HT受體HTR2C。GRAB5-HT1.0探針能夠在培養(yǎng)的細胞、小鼠腦切片、活體果蠅以及小鼠大腦中檢測5-HT的動態(tài)變化。GRAB5-HT1.0探針還具有很高的特異性，在檢測細胞外5-HT動態(tài)變化時也表現(xiàn)出極高的靈敏度。此外，李毓龍團隊利用此探針在自由活動小鼠的睡眠-覺醒周期中檢測到5-HT的動態(tài)變化，表明GRAB5-HT1.0探針可以被廣泛應用于檢測活體動物大腦中的5-HT。
我們希望借助GRAB5-HT1.0探針及其升級版本等創(chuàng)新型工具，盡快揭示5-HT神經(jīng)元活性與5-HT釋放之間的關系及其對下游神經(jīng)元的影響。希望在不久的將來，這些新的發(fā)現(xiàn)將能夠幫助我們更好地了解5-HT能系統(tǒng)，并最終理解5-HT在精神疾病中的作用。
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任超然（暨南大學研究員，國家優(yōu)青獲得者）
5-HT是大腦內(nèi)重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，可作用于表達在不同腦區(qū)細胞上的5-HT受體，調(diào)節(jié)神經(jīng)活動，進而影響機體的情緒、認知、睡眠等重要生理功能。在大腦中，5-HT主要由背側(cè)中縫核（DRN）的5-HT能神經(jīng)元合成，該類神經(jīng)元廣泛支配眾多下游腦區(qū)，構(gòu)成了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT系統(tǒng)。5-HT系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復雜，一方面是因為5-HT神經(jīng)元投射廣泛，另一方面單個腦區(qū)內(nèi)往往包含多種不同類型受體和神經(jīng)元。因此，解析5-HT系統(tǒng)在特定行為中的作用及調(diào)控機制一直是神經(jīng)科學研究的前沿熱點之一。而精確測量特定腦區(qū)中5-HT水平的動態(tài)變化是回答以上問題的關鍵。
北京大學李毓龍教授所領導的團隊是新型神經(jīng)遞質(zhì)感受器研發(fā)領域的先驅(qū)，近年來他們已自主研發(fā)了可高效檢測乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、腺苷等神經(jīng)遞質(zhì)的探針，上述探針已廣泛應用于神經(jīng)環(huán)路功能及遞質(zhì)釋放調(diào)控機理等領域的研究。近日，Nature Neuroscience報道了李毓龍教授團隊自主研發(fā)的新型5-HT探針，5-HT1.0。他們通過對天然5-HT受體5-HT2C進行改造，巧妙的在其中插入對構(gòu)象敏感的綠色熒光蛋白cpGFP，使得該嵌合體與5-HT結(jié)合時可發(fā)生構(gòu)象變化，使綠色熒光信號上升，因此可通過檢測熒光亮度變化來反應5-HT水平的變化。在該工作中，他們還通過一系列離體（HEK293T細胞，小鼠腦片）與在體（果蠅，小鼠）實驗證明5-HT1.0探針對5-HT具有較高親和力及特異性、反應迅速等優(yōu)點，而且該探針的表達不會對胞內(nèi)信號通路產(chǎn)生明顯干擾。更為重要的是，5-HT1.0探針與遺傳學（如病毒載體）及在體光學記錄工具（如光纖記錄）相結(jié)合，可在自由活動動物中動態(tài)觀測特定腦區(qū)不同類型神經(jīng)元所接收的5-HT輸入。5-HT1.0探針的研發(fā)無疑為解析5-HT系統(tǒng)在特定行為中的作用及調(diào)控機制提供了一大利器，也期待李毓龍教授團隊在神經(jīng)遞質(zhì)探針研發(fā)領域再創(chuàng)佳績。
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李曉明（浙江大學教授，長江學者）
二十世紀八十年代，人們發(fā)現(xiàn)5-HT再攝取抑制劑具有抗抑郁作用，由此引發(fā)了5-HT系統(tǒng)研究的熱潮。隨后的三十年間，人們對5-HT系統(tǒng)進行了較為全面的研究。這些研究描述了5-HT受體系統(tǒng)的復雜性，也揭示了5-HT系統(tǒng)在情緒、穩(wěn)態(tài)和本能行為中的重要調(diào)控作用。但是，由于缺乏精準的5-HT檢測手段，5-HT信號傳遞相關的研究進展十分緩慢；5-HT的動態(tài)變化如何調(diào)節(jié)生理功能，5-HT再攝取抑制劑起效時間的延遲是否與其動態(tài)變化有關，目前仍不清楚。
近年來，北京大學李毓龍教授團隊致力于開發(fā)可遺傳編碼的神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)熒光探針，創(chuàng)造性地實現(xiàn)了多種神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)（如乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、腺苷等）在高時空分辨率上的在體可視化檢測，推動神經(jīng)遞質(zhì)的研究進入在體定量研究的新時代。利用這些探針，人們對多巴胺、腺苷等神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)的功能有了全新的認識。
在2019年冷泉港亞洲會議的報告和學術(shù)海報中，李毓龍教授團隊就初步展示了關于5-HT熒光探針的研究進展，令人感到十分興奮。近日，李毓龍教授團隊研發(fā)的新型5-HT探針正式在Nature Neuroscience發(fā)表。該探針具有高度的特異性、合適的親和力和動力學特性，可用于檢測在體生理和病理條件下腦內(nèi)5-HT的動態(tài)變化。文章中果蠅和小鼠兩種常見模式動物的數(shù)據(jù)，表明該探針在體應用中具有較高的信噪比和時空分辨率，能夠反映不同腦區(qū)5-HT水平隨時間的動態(tài)變化情況。本人實驗室有幸提前使用李毓龍教授團隊的5-HT探針，檢測了特定行為情況下小鼠腦內(nèi)特定腦區(qū)5-HT的動態(tài)變化情況，發(fā)現(xiàn)其具有極高的靈敏度。相信該探針將為5-HT系統(tǒng)的研究帶來突破性的進展。此外，近年來，在乙酰膽堿、多巴胺熒光探針的研發(fā)中，李毓龍教授團隊不斷進行更新迭代，開發(fā)了能夠應用于不同腦區(qū)的高靈敏度探針。與乙酰膽堿、多巴胺系統(tǒng)相比，5-HT系統(tǒng)更為復雜，作用范圍也更加廣泛。因此，我們十分期待下一代5-HT探針的出現(xiàn)。
我們震撼于李毓龍教授團隊關于神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)熒光探針的一系列工作，也非常感謝他們在材料資源上的開放和共享。
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