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近日，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、微生物代謝國家重點實驗室馮雁團隊在Nucleic Acids Research上發(fā)表題為“Argonaute integrated single-tube PCR system enables supersensitive detection of rare mutations”的文章。該工作揭示了不同高溫微生物 Argonaute蛋白的核酸酶特性，發(fā)現(xiàn)其對單堿基突變（SNV）靶標序列精準識別的規(guī)律，發(fā)展了“一管式”PCR多重核酸富集和檢測的A-Star (Ago-Directed Specific Target Enrichment and Detection)新策略，實現(xiàn)血液等樣本中低豐度突變基因的高效、多重富集和檢測。上海交通大學(xué)副研究員劉倩和博士生郭翔為該論文共同第一作者，馮雁教授為通訊作者。研究工作由上海交通大學(xué)、上海交通大學(xué)附屬第一醫(yī)院、仁濟醫(yī)院、人和未來生物科技公司等合作完成。上海交通大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心提供研究平臺支持。

對血液或體液中腫瘤細胞釋放DNA片段的液體活檢，憑借其無創(chuàng)性、敏感性、動態(tài)性等特質(zhì)，可實現(xiàn)腫瘤早期篩查及伴隨診斷。然而，由于游離核酸含量低和易降解，因此在復(fù)雜背景基因中來特異性富集和檢測腫瘤基因得到廣泛關(guān)注。常用的PCR等方法具有簡單、省時等優(yōu)點，但其檢測靈敏度有限；近年來，基因編輯工具酶CRISPR/Cas在核酸檢測中的應(yīng)用，提升了檢測靈敏度和便捷性，但Cas酶對靶標序列PAM選擇性、長RNA guide合成昂貴且不穩(wěn)定等問題，導(dǎo)致檢測成本、靈敏度、多重性等方面仍存在局限性。因此，研發(fā)能特異性富集靶標序列的新型核酸酶是解決上述難題的有效途徑，建立高靈敏度、多重和簡便的新型核酸檢測技術(shù)對于基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用都具有重要意義。

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圖1. “A-Star”低豐度?SNV富集和檢測工作原理

論文作者在對嗜熱微生物Ago蛋白的系統(tǒng)研究中，揭示其高溫穩(wěn)定性、可編程性、特異性催化活性、多重正交反應(yīng)等優(yōu)良特性，提出了Argonaute?(Ago)核酸酶-PCR耦聯(lián)的“A-Star”?(Ago-Directed Specific Target Enrichment and Detection)核酸檢測和富集的新策略（圖1）。巧妙采用guide DNA“雙點錯配”設(shè)計的策略，使Ago蛋白在PCR變性步驟（94 ^oC）選擇性剪切野生型基因，保留的突變基因可在PCR退火（～58?^oC）、延伸（～72 ^oC）步驟中得以循環(huán)擴增，實現(xiàn)低豐度突變基因的超高效率富集和精準檢測。研究人員對KRAS、PIK3CA和EGFR等多個腫瘤突變基因進行富集，證實A-Star能檢測0.01%的低豐度突變，富集效率高達5,500倍。

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圖2. “A-Star”用于臨床樣品（A）及多重腫瘤突變（B）的富集和檢測?

“A-Star”在血液和實體瘤組織等復(fù)雜樣品中能穩(wěn)定檢出靶標腫瘤基因（圖2A）?？紤]到實際樣本中可能存在多種基因突變，通過設(shè)計多對DNA引導(dǎo)鏈，“A-Star”在單酶“一管式”反應(yīng)體系中實現(xiàn)了多腫瘤基因的檢測，且信號之間無交叉干擾（圖2B）。總之，本研究所建立的“A-Star”低豐度核酸富集和檢測技術(shù)，具有極高靈敏度、簡便快捷及多重檢測等分子檢測優(yōu)勢，在基因診斷及遺傳疾病治療等分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用潛力。

本研究得到了國家自然科學(xué)基金面上項目（31770078）和科技部重點研發(fā)計劃（2020YFA0907700）的經(jīng)費支持。

文章鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkab274

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