Nat Methods | 伊成器課題組開發(fā)胞嘧啶堿基編輯器全基因組脫靶效應(yīng)檢測的新工具
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2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了Emmanuelle Charpentier和Jennifer A. Doudna，以表彰她們發(fā)展了基于CRIPSR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯工具。但CRISPR-Cas9系統(tǒng)在進(jìn)行基因編輯的過程中有可能會(huì)脫靶產(chǎn)生DNA雙鍵斷裂（double strand break, DSB），從而造成基因組的不穩(wěn)定【1】。
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Broad institute的David R. Liu教授在2016年在CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基礎(chǔ)上通過融合脫氨酶（rAPOBEC）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）發(fā)展了不會(huì)產(chǎn)生DNA雙鍵斷裂就可以進(jìn)行基因組特定位點(diǎn)的C-to-T編輯的胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor, CBE）【2】。由于CBE系統(tǒng)在編輯過程中不產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，所以一般認(rèn)為CBE系統(tǒng)比CRISPR-Cas9系統(tǒng)擁有更高的安全性。但是，在真正將CBE應(yīng)用到臨床進(jìn)行遺傳疾病治療前，有必要對其安全性與特異性進(jìn)行評估。
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圖- 1 CBE通過產(chǎn)生中間產(chǎn)物脫氧尿嘧啶（dU），實(shí)現(xiàn)堿基編輯【3】
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針對CBE造成的DNA脫靶（off-targets）效應(yīng)，目前已有的全基因組檢測技術(shù)包括：（1）基于體外生化孵育后測序的Digenome-seq技術(shù)【4】；（2）基于檢測Cas9蛋白介導(dǎo)產(chǎn)生DSB的GUIDE-seq【5】，CIRCLE-seq【6】等技術(shù)；（3）基于生物信息學(xué)序列預(yù)測的Cas-OFFinder【7】等軟件；（4）基于單細(xì)胞、單克隆技術(shù)擴(kuò)增后進(jìn)行全基因組測序的技術(shù)【8-10】等。然而，依然缺乏靈敏、高效的檢測手段，無偏向性地鑒定CBE在體內(nèi)造成的脫靶位點(diǎn)。
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2021年6月7日，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院伊成器課題組在Nature Methods雜志發(fā)表了題為“Detect-seq reveals out-of-protospacer editing and target-strand editing by cytosine base editors”的文章。研究人員巧妙地利用了CBE在進(jìn)行靶向編輯過程中會(huì)產(chǎn)生中間產(chǎn)物脫氧尿嘧啶（dU）這一特點(diǎn)，對CBE產(chǎn)生的dU進(jìn)行生物素（biotin）標(biāo)記、富集；同時(shí)在dU位點(diǎn)的附近，將正常胞嘧啶C替換為d5fC，結(jié)合后續(xù)的化學(xué)標(biāo)記反應(yīng)【11-13】，產(chǎn)生串聯(lián)C-to-T的信號從而增敏脫靶編輯的檢測，開發(fā)了名為Detect-seq（dU-detection enabled by C to T transition during sequencing）的CBE脫靶檢測技術(shù)。
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圖- 2 Detect-seq實(shí)驗(yàn)流程示意圖
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研究人員首先在人胚腎細(xì)胞HEK293T和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7轉(zhuǎn)染BE4max，分別使用4種、2種不同的sgRNA對基因組靶向位點(diǎn)進(jìn)行C-to-T的編輯；同時(shí)對這些樣本中進(jìn)行了Detect-seq檢測。通過Detect-seq檢測發(fā)現(xiàn)，除RNF2位點(diǎn)外，其它靶向位點(diǎn)均可以產(chǎn)生幾十至數(shù)百個(gè)Cas9依賴型的脫靶位點(diǎn)。
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圖- 3 在三種不同sgRNA樣品中鑒定到的Cas依賴型的脫靶位點(diǎn)。其中藍(lán)色圓圈代表脫靶位點(diǎn)（off-targets），紅色方塊代表靶向位點(diǎn)（on-target） EMX1 n=48，VEGFA_site_2 n=511， HEK293_site_4 n=245
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隨后，研究人員比較了由Detect-seq鑒定到的脫靶位點(diǎn)與之前研究報(bào)道的使用體外生化孵育Digenome-seq方法或基于Cas-OFFinder軟件預(yù)測的脫靶位點(diǎn)。通過靶向擴(kuò)增子測序的驗(yàn)證（targeted amplicon sequencing），由Detect-seq鑒定的脫靶位點(diǎn)均可以在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著高于背景的C-to-T的突變；而僅僅被體外生化孵育Digenome-seq方法或基于Cas-OFFinder軟件預(yù)測到的脫靶位點(diǎn)，則沒有表現(xiàn)出顯著高于測序背景的C-to-T的突變。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析則表明，Detect-seq鑒定到的脫靶位點(diǎn)顯著富集于活躍轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)、基因啟動(dòng)子區(qū)等開放染色質(zhì)區(qū)域，與體外實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)預(yù)測結(jié)果呈現(xiàn)了鮮明的對比。
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圖- 4 Detect-seq技術(shù)與體外孵育檢測技術(shù)Digenome-seq及預(yù)測軟件Cas-OFFinder相比，鑒定到的位點(diǎn)富集于活躍轉(zhuǎn)錄區(qū)等染色質(zhì)開放區(qū)域。
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在Detect-seq之前，領(lǐng)域內(nèi)常使用檢測DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks, DSBs）的技術(shù)（如GUIDE-seq，CIRCLE-seq等）檢測由Cas蛋白核酸內(nèi)切酶切割DNA雙鏈造成的脫靶效應(yīng)。并以此來替代CBE系統(tǒng)造成的脫靶效應(yīng)。在文章中，研究人員也比較了Detect-seq與GUIDE-seq在三種sgRNA樣品中鑒定到的Cas依賴型脫靶位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除EMX1位點(diǎn)外，剩余兩個(gè)sgRNA樣品中Detect-seq均檢測出遠(yuǎn)多于GUIDE-seq的Cas依賴型脫靶位點(diǎn)。這提示了Cas蛋白的結(jié)合活性造成的脫靶與其核酸內(nèi)切酶造成的脫靶可能不同。
有趣的是，研究人員基于Detect-seq技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了兩種新型的Cas依賴型的脫靶編輯：sgRNA結(jié)合區(qū)域外編輯（out-of-protospacer edit）及靶向鏈編輯（target-strand edit）。
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圖- 5 CBE介導(dǎo)的sgRNA結(jié)合區(qū)域外編輯與靶向鏈編輯 sgRNA結(jié)合區(qū)域使用陰影標(biāo)出，IGV圖中紅色方塊代表正鏈C-to-T突變，綠色方塊代表反鏈C-to-T突變；圖下半部分為該區(qū)域靶向擴(kuò)增子測序結(jié)果。
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sgRNA結(jié)合區(qū)域外編輯即C-to-T的編輯發(fā)生在sgRNA結(jié)合區(qū)域外；而靶向鏈編輯則是C-to-T編輯發(fā)生在sgRNA與DNA結(jié)合鏈。根據(jù)Detect-seq的結(jié)果，上述兩種編輯普遍存在于Cas依賴型的脫靶位點(diǎn)的結(jié)合區(qū)域。值得一提的是，雖然RNF2位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)Cas依賴型的脫靶，但是在其靶向位點(diǎn)的靶向鏈發(fā)現(xiàn)了顯著高于測序背景的C-to-T編輯。根據(jù)后續(xù)的機(jī)器學(xué)習(xí)計(jì)算結(jié)果，研究者認(rèn)為sgRNA 5’端錯(cuò)配和PAM附近的錯(cuò)配可能是影響sgRNA結(jié)合區(qū)域外編輯和靶向鏈編輯的關(guān)鍵因素。
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圖- 6 sgRNA結(jié)合區(qū)域外編輯與靶向鏈編輯模式圖
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隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)，除了上述Cas依賴型的脫靶位點(diǎn)，Detect-seq技術(shù)也可以在轉(zhuǎn)染BE4max的樣品中檢測到一些信號明顯較弱、刪除sgRNA后依然存在，但刪除脫氨酶后降低至背景水平的Cas非依賴型脫靶。對于上述位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，該種位點(diǎn)主要發(fā)生在TC motif中的C中，與之前報(bào)道的rAPOBEC偏好性相同【14】。
Detect-seq技術(shù)為堿基編輯領(lǐng)域內(nèi)提供了一種能夠高靈敏、高特異、無偏好性地檢測細(xì)胞內(nèi)的CBE脫靶位點(diǎn)的方法。脫靶效應(yīng)理解的加深，也將為闡明CBE的催化機(jī)制、優(yōu)化改造更安全的CBE工具帶來新的視角與可能。為了便于Detect-seq技術(shù)的使用，研究人員還為Detect-seq編寫了配套的生物信息學(xué)分析軟件（代碼已上傳至Github，詳見論文Methods部分）。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41592-021-01172-w
新聞稿出處：BioArt
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