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蛋白質(zhì)磷酸化是最重要的翻譯后修飾之一，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化增殖、應(yīng)激響應(yīng)等生命過程中都扮演著極為重要的角色，更直接影響了包括腫瘤在內(nèi)等諸多疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在過去的幾十年中，得益于質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)日趨完善，并在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用【1】。

眾所周知，真核細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)高度區(qū)室化的特征，其中生物大分子的空間分布具有很強(qiáng)的異質(zhì)性。精準(zhǔn)解讀不同細(xì)胞器和亞細(xì)胞區(qū)域的蛋白質(zhì)磷酸譜，能夠極大的促進(jìn)我們對于磷酸化功能的認(rèn)知【2】。然而，現(xiàn)有的磷酸化蛋白質(zhì)組技術(shù)并不具備亞細(xì)胞水平的空間分辨率，難以實(shí)現(xiàn)對亞細(xì)胞區(qū)域磷酸化蛋白質(zhì)譜的深度繪制。

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近日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院陳鵬課題組與鄒鵬課題組在PNAS上合作發(fā)表題為“Spatiotemporally resolved subcellular phosphoproteomics”的論文，利用生物正交剪切反應(yīng)和化學(xué)脫籠策略，構(gòu)建了可控激活的鄰近標(biāo)記酶，并進(jìn)一步與磷酸化富集技術(shù)相偶聯(lián)，開發(fā)了首個基于生物正交鄰近標(biāo)記的亞細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組捕獲技術(shù)——SubMAPP（Subcellular-specific uncaging-assisted biotinylation and MApping of PhosphoProteome），成功實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中亞微米分辨率下的磷酸化蛋白質(zhì)組捕獲，并將其拓展至神經(jīng)元及活體動物等復(fù)雜體系。

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近年來，以過氧化物酶（APEX/HRP）和生物素連接酶（TurboID/BioID）為代表的鄰近標(biāo)記酶，因其優(yōu)異的空間分辨率和普適性，在空間蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注【3】。然而，現(xiàn)有方法局限于表征蛋白質(zhì)的豐度，無法進(jìn)行亞細(xì)胞水平的翻譯后修飾組學(xué)研究，因而不能體現(xiàn)出蛋白質(zhì)翻譯后修飾可逆和動態(tài)的特性。例如，APEX和HRP需要高達(dá)1 mM的過氧化氫誘發(fā)標(biāo)記反應(yīng)，而Turbo在細(xì)胞中的表達(dá)會造成大規(guī)模的蛋白質(zhì)生物素化，這些都會在一定程度上影響蛋白質(zhì)的翻譯后修飾譜【4,5】。因此，迫切需要一種生物正交、時空可控的化學(xué)標(biāo)記工具，用于開展亞細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學(xué)研究。

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受此啟發(fā)，陳鵬課題組基于在蛋白質(zhì)生物正交激活領(lǐng)域的前期積累【6】，與鄒鵬課題組合作，利用遺傳密碼子拓展技術(shù)實(shí)現(xiàn)了最新一代生物素連接酶Turbo的光控激活（photoTurbo）和化學(xué)激活（chemoTurbo）。通過對酶活性的直接調(diào)控，而非生物素的補(bǔ)充來控制其對鄰近蛋白質(zhì)的標(biāo)記，生物正交激活Turbo顯著降低了野生型Turbo利用內(nèi)源生物素標(biāo)記的背景，消除了內(nèi)源蛋白質(zhì)過度生物素化，以及生物素剝奪對蛋白質(zhì)翻譯后修飾產(chǎn)生的干擾。同時，在亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的特異性和覆蓋率上，生物正交激活Turbo也毫不遜色于野生型Turbo。

圖1. SubMAPP工作流程

在此基礎(chǔ)上，作者進(jìn)一步發(fā)展了“串聯(lián)富集”的策略，將鄰近標(biāo)記酶介導(dǎo)的空間蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與特定蛋白質(zhì)翻譯后修飾富集技術(shù)有效整合，實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞區(qū)域特定翻譯后修飾蛋白質(zhì)組的深度捕獲。他們成功富集了活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的磷酸化蛋白質(zhì)組，確定了分泌途徑中主要的磷酸化氨基酸殘基序列為S-P-E，并鑒定到了部分已知分泌相關(guān)激酶FAM20C的底物和新的磷酸化修飾蛋白/位點(diǎn)。隨后，作者應(yīng)用該技術(shù)解析了在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，腔內(nèi)蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組的動態(tài)變化。有趣的是，通過設(shè)計的“脈沖-追蹤”實(shí)驗，他們揭示了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體之間的“蛋白質(zhì)穿梭”現(xiàn)象。最后，作者還將SubMAPP技術(shù)拓展到了體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元和活體小鼠水平，進(jìn)一步展示了該技術(shù)的高效性和普適性。

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綜上，該項研究構(gòu)建了一種生物正交、時空可控的鄰近標(biāo)記酶，并結(jié)合磷酸化串聯(lián)富集策略，發(fā)展了亞細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)。未來，該策略有望拓展至其他翻譯后修飾類型，在亞細(xì)胞水平繪制多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾譜。

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北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士后劉衍軍、博士研究生曾如馨為該論文的共同第一作者，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳鵬教授和鄒鵬研究員為該論文的共同通訊作者。該工作得到了國家自然科學(xué)基金委、科技部、北京分子科學(xué)國家研究中心以及北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。

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原文鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.2025299118

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1. Humphrey, S., Azimifar, S. & Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nat. Biotechnol., 33, 990–995 (2015)

2. Altelaar, A. F. M., Munoz, J. & Heck, A. J. R. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat. Rev. Genet., 14, 35-48 (2013).

3. Zhou, Y., Zou, P. The evolving capabilities of enzyme-mediated proximity labeling. Curr. Opin. Chem. Biol., 60, 30-38 (2021).

4. Vepa, S. et al. Hydrogen peroxide stimulates tyrosine phosphorylation of focal adhesion kinase in vascular endothelial cells. Am. J. Physiol. 277, 150-158 (1999).

5. Madsen, C. T. et al. Biotin starvation causes mitochondrial protein hyperacetylation and partial rescue by the SIRT3-like deacetylase Hst4p. Nat. Comm., 6, e7726 (2015)

6. Wang, J.,?Wang, X.,?Fan, X., Chen, P. R. Unleashing the Power of Bond Cleavage Chemistry in Living Systems.?ACS Cent. Sci.,?(2021). DOI: 10.1021/acscentsci.1c00124.

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