NBE | 夏青課題組利用基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)治療無義突變罕見病
yle="margin-top: 4px; text-indent: 28px; line-height: 24px; text-align: justify;">提罕見病，又稱為“孤兒病”，一般為慢性的嚴(yán)重性疾病，常危及生命。罕見病種類已達(dá)8000多種，只有不到1%的疾病具有可行的治療方案，其中80%以上的罕見病是由遺傳因素導(dǎo)致的，50%以上的罕見病會(huì)在出生時(shí)和兒童期發(fā)病并導(dǎo)致死亡。中國(guó)約2000萬的罕見病患者，且每年新增患者超過20萬。而廣泛分布的罕見病，如苯丙酮尿癥、β地中海貧血、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等，多為單基因遺傳病，即由單個(gè)基因突變導(dǎo)致的遺傳性疾病。
杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy)，簡(jiǎn)稱DMD，是一種X染色體隱性遺傳病，由編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的基因突變引起，主要在男孩中發(fā)病，突變中約有10%是無義突變類型，即編碼氨基酸的密碼子突變?yōu)樘崆敖K止密碼子（premature termination codon, PTC），屬于PTC疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球平均每3500個(gè)新生男嬰中就有一人罹患此病，我國(guó)的發(fā)病率高于此比例。患者一般在3-5歲開始發(fā)病，最早表現(xiàn)出進(jìn)行性腿部肌無力，導(dǎo)致不便行走。12歲時(shí)失去行走能力，20歲-30歲因呼吸衰竭而死亡。目前該病尚無有效的治療方法。
基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)利用終止密碼子編碼人工合成氨基酸（unnatural amino acid, UAA）的前沿生物技術(shù)，可精準(zhǔn)的用于PTC位點(diǎn)引入UAA，而不影響蛋白正常終止密碼子的翻譯功能。此項(xiàng)技術(shù)主要使用aaRS（aminoacyl-tRNA synthetase）/tRNA正交系統(tǒng)在發(fā)生無義突變的位點(diǎn)通讀突變密碼子，達(dá)到翻譯全長(zhǎng)蛋白的治療目的。
北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室夏青教授在生命科學(xué)相關(guān)領(lǐng)域有著多重交叉學(xué)術(shù)背景，所涉及方向有臨床醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、無機(jī)化學(xué)及生物化學(xué)，具有敏銳且新穎的科學(xué)研究視角，立足前沿生物技術(shù)領(lǐng)域，面向醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)重要問題。
2021年8月2日，夏青團(tuán)隊(duì)在Nature Biomedical Engineering在線發(fā)表了文章“Restoration of dystrophin expression in mice by suppressing a nonsense mutation through the incorporation of unnatural amino acids”，該研究首次實(shí)現(xiàn)了利用基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)恢復(fù)內(nèi)源性Dystrophin蛋白的全長(zhǎng)表達(dá)，在肌肉干細(xì)胞和PylRS/mdx小鼠疾病模型上系統(tǒng)評(píng)價(jià)了該方法用于治療DMD的安全性、有效性和可行性，并完成了不同方式遞送AAV-PylRS-tRNAPyl的安全性和治療效果評(píng)價(jià)，為DMD和無義突變罕見病治療提供了新策略。此項(xiàng)研究已于2016年申報(bào)中國(guó)和美國(guó)專利，目前正積極投入臨床前實(shí)驗(yàn)研究中。
在該課題中，研究者選擇了吡咯賴氨酸系統(tǒng)PylRS-tRNAPyl，該系統(tǒng)可以將非天然氨基酸NAEK定點(diǎn)插入到蛋白質(zhì)。研究者首先拓展了可以通讀3種提前終止密碼子（TAG、TGA與TAA）的PylRS-tRNAPyl系統(tǒng)，在HEK293T細(xì)胞中 驗(yàn)證非天然氨基酸NAEK依賴性和正交性。然后，研究者構(gòu)建了含不同PTC位點(diǎn)的dystrophin模型蛋白Dp71b，將其質(zhì)粒與PylRS-tRNAPyl系統(tǒng)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染給HEK293T細(xì)胞，證明3種正交系統(tǒng)均可通讀模型蛋白Dp71b。進(jìn)一步，研究者在從疾病模型mdx小鼠和DMD病人分離得到的肌肉分化干細(xì)胞上進(jìn)行驗(yàn)證，均檢測(cè)到dystrophin蛋白的表達(dá)恢復(fù)，初步驗(yàn)證PylRS-tRNAPyl系統(tǒng)可以在細(xì)胞水平恢復(fù)內(nèi)源Dystrophin蛋白的全長(zhǎng)表達(dá)。
在動(dòng)物層面上，研究者首先嘗試將PylRS-tRNAPyl質(zhì)粒直接電穿孔轉(zhuǎn)染到小鼠的脛前肌中，dystrophin可恢復(fù)少量表達(dá)，初步表明了該方法可以在mdx小鼠上恢復(fù)內(nèi)源蛋白表達(dá)。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該方法用于DMD疾病不同組織的長(zhǎng)期治療效果，解決電轉(zhuǎn)對(duì)小鼠組織的損傷和質(zhì)粒降解問題，研究者創(chuàng)新性的建立了含有編碼新型氨基酸的PylRS-tRNAPyl正交轉(zhuǎn)基因小鼠，將其和發(fā)病mdx小鼠交配獲得PylRS/mdx轉(zhuǎn)基因疾病小鼠模型，此模型可以穩(wěn)定表達(dá)PylRS/tRNAPyl系統(tǒng)并呈現(xiàn)mdx小鼠類似的dystrophin缺陷，因此適合長(zhǎng)期治觀察療效。對(duì)小鼠進(jìn)行8周的腹腔注射NAEK，在第1, 2, 4, 6, 8周分別對(duì)小鼠進(jìn)行握力測(cè)試，肌肉組織dystrophin蛋白表達(dá)量檢測(cè)，血液生化檢測(cè)，組織病理染色分析及安全性評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠在注射NAEK第4周后蛋白恢復(fù)量達(dá)到平臺(tái)期（30%左右），與對(duì)照組小鼠相比，第4, 6, 8周實(shí)驗(yàn)組小鼠的握力明顯增加，CK激酶含量下降，肌肉組織的正常肌細(xì)胞的比例明顯上升，表明該方法可恢復(fù)小鼠dystrophin蛋白全長(zhǎng)表達(dá)及其部分生理功能，治療效果顯著，遠(yuǎn)優(yōu)于小分子通讀藥物治療。
最后，為評(píng)價(jià)該方法推向臨床治療應(yīng)用的可行性/可轉(zhuǎn)化性，研究者用AAV作為載體構(gòu)建了AAV-PylRS-tRNAPyl系統(tǒng)，以腹腔注射和肌肉注射兩種方式，分別評(píng)價(jià)其在mdx小鼠上的全身/局部治療效果，兩種方式注射AAV-PylRS-tRNAPyl均有明顯治療效果，均呈現(xiàn)出NAEK依賴性，可以通過停用或調(diào)整非天然氨基酸的用量來控制基因治療的效果，有望實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的可控治療。
綜上，該項(xiàng)研究使化學(xué)家建立的體外蛋白質(zhì)定點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)突破性的走進(jìn)醫(yī)學(xué)的世界，實(shí)現(xiàn)了在體內(nèi)任意氨基酸的精準(zhǔn)替換，拓展了人工合成氨基酸在生物醫(yī)學(xué)中的廣闊應(yīng)用前景。并且首次實(shí)現(xiàn)人工氨基酸正交翻譯體系在無義突變疾病中的實(shí)驗(yàn)性治療，這是繼小分子通讀藥物、單堿基基因編輯之后的第三種通用治療罕見病的方法，有望引領(lǐng)新一代生物治療的醫(yī)學(xué)前沿陣地。
北京大學(xué)藥學(xué)院夏青團(tuán)隊(duì)研究生史寧寧、楊琦，博士后張浩然為該論文的共同第一作者，夏青教授為通訊作者。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-021-00774-1
天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室? 供稿
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com