2021年5月24日,清華大學饒子和院士、婁智勇研究員團隊與上科大高巖博士合作在《Cell》雜志發(fā)表研究論文,解析新冠病毒超分子蛋白質(zhì)機器“轉(zhuǎn)錄復制復合體”關鍵狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu),揭示了病毒mRNA加帽、基因組復制矯正、逃逸核苷類抗病毒藥物的分子機制。這是該團隊在新冠病毒轉(zhuǎn)錄復制復合體研究中,繼在《Science》、《Cell》等期刊上連續(xù)發(fā)表4項成果后的又一重要工作。
新冠病毒肺炎疫情至今已造成全球1.4億人感染和300余萬人死亡。隨著疫情進展,突變病毒株不斷出現(xiàn),對中和抗體和疫苗的防護效果提出了嚴重挑戰(zhàn),迫切需要針對各型突變株中高度保守的轉(zhuǎn)錄復制過程開展深入研究,闡明關鍵藥物靶點的工作機制,發(fā)現(xiàn)能夠有效應對各種突變株的抗病毒藥物。
新冠病毒是目前已知RNA病毒中基因組最大的一種病毒(約30 kb),其基因組編碼了一系列非結(jié)構(gòu)蛋白,并按照一定的空間和時間順序,形成復雜的超分子蛋白質(zhì)機器“轉(zhuǎn)錄復制復合體”(RTC),負責病毒轉(zhuǎn)錄復制的核心過程,包含了眾多保守的抗病毒藥物設計的關鍵靶點。由于基因組極大,同時聚合酶復制保守性較差,新冠病毒進化出一種獨特的“復制矯正”(proofreading)機制,利用轉(zhuǎn)錄復制復合體中關鍵的nsp14蛋白對復制過程進行矯正,一旦發(fā)現(xiàn)聚合酶合成了錯誤配對的堿基,立刻通過nsp14具有的外切核酸酶(ExoN)將錯誤堿基處理掉,保證復制的準確進行,這也是病毒逃逸核苷類抗病毒藥物的關鍵途徑。同時,nsp14是一個獨特的雙功能蛋白,除負責復制矯正的外切核酸酶外,還擁有一個N7甲基化酶(N7-MTase),負責mRNA加帽過程關鍵的第三步催化反應。復制矯正和加帽過程如何進行,特別是兩個截然不同的生化過程如何在一個nsp14蛋白中協(xié)同作用,是20多年來冠狀病毒研究領域中最關鍵的幾個“未解之謎”之一。
新冠疫情爆發(fā)后,清華大學饒子和院士、婁智勇研究員團隊針對新冠病毒轉(zhuǎn)錄復制機制開展的深入研究,先后闡明了“核心轉(zhuǎn)錄復制復合體”(C-RTC)[1]、“延伸轉(zhuǎn)錄復制復合體”(E-RTC)[2]和“加帽中間態(tài)轉(zhuǎn)錄復制復合體”[Cap(-1)’-RTC][3]的工作機制。在此基礎上,研究團隊成功解析了Cap(-1)’-RTC與nsp10/nsp14形成的超級復合體Cap(0)-RTC的三維結(jié)構(gòu)(圖1)。
圖1 新冠病毒Cap(0)-RTC的工作機制
在該復合體中,nsp9蛋白發(fā)揮了“適配器”(adaptor)的作用,通過與nsp14蛋白相互作用,將nsp10/nsp14復合體招募到Cap(-1)’-RTC中,從而利用nsp14的N7甲基化酶結(jié)構(gòu)域完成mRNA加帽過程的第三步關鍵反應。尤為重要的是,研究團隊發(fā)現(xiàn)Cap(0)-RTC在溶液狀態(tài)下會形成穩(wěn)定的同源二聚體。在二聚體中,解旋酶nsp13通過其1B結(jié)構(gòu)域的重大構(gòu)象變化,引導模板核酸鏈反向移動,引發(fā)產(chǎn)物鏈backtracking機制,從而將產(chǎn)物鏈3’末端傳輸至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶結(jié)構(gòu)域的反應中心,完成錯配堿基的矯正過程(圖2及動畫)。
圖2新冠病毒復制矯正的in transbacktracking機制
這一發(fā)現(xiàn)所提出的in transbacktracking的復制矯正機制,與真核/原核細胞RNA聚合酶Pol II的復制矯正機制具有一定的類似性,表明作為基因組最復雜的RNA病毒,新冠病毒的轉(zhuǎn)錄復制過程已與高等生物具有一定的類似性,闡明了冠狀病毒研究領域20多年來懸而未決的關鍵科學問題。同時,復制矯正機制是新冠病毒逃逸核苷類抗病毒藥物(如瑞德西韋)的關鍵機制,一旦核苷類藥物被加入RNA產(chǎn)物鏈中,即會被病毒的復制矯正過程去除,從而喪失抑制活性,目前僅有NHC及其衍生物可以逃逸該過程。該成果也將對未來進一步優(yōu)化和發(fā)展新型核苷類抗病毒藥物提供關鍵的結(jié)構(gòu)基礎。相關研究成果于2021年x月x日在Cell在線發(fā)表[3]。
該成果的獲得得益于研究團隊在冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復制領域中17年多的長期積累。自新冠疫情發(fā)生后,研究團隊系統(tǒng)研究了新冠病毒轉(zhuǎn)錄復制過程,闡明了關鍵藥物靶點蛋白主蛋白酶Mpro和轉(zhuǎn)錄復制復合體多個狀態(tài)三維結(jié)構(gòu),為認識病毒的生命過程、發(fā)展高效抗病毒藥物提供了關鍵信息,先后在Nature[4]、Science[1]、Cell上[3, 5]和NatureCommunications[2]上發(fā)表系列研究論文,是國際上抗新冠藥物靶點研究中最為系統(tǒng)、引用最多的工作之一。
清華大學饒子和院士、婁智勇研究員/長江學者特聘教授和上??萍即髮W的高巖博士為共同通訊作者,清華大學醫(yī)學院和生命學院的閆利明博士、楊云翔博士,以及博士生李明宇、張盈、鄭禮濤、葛基、黃雨岑、劉震宇為共同第一作者,研究工作得到上??萍即髮W冷凍電鏡平臺的重要支持,受到科技部重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、清華大學春風基金、中科院先導專項的資助。
參考文獻
1. Gao, Y., L. Yan, Y. Huang, F. Liu, Y. Zhao, L. Cao, T. Wang, Q. Sun, Z. Ming, L. Zhang, J. Ge, L. Zheng, Y. Zhang, H. Wang, Y. Zhu, C. Zhu, T. Hu, T. Hua, B. Zhang, X. Yang, J. Li, H. Yang, Z. Liu, W. Xu, L.W. Guddat, Q. Wang, Z. Lou and Z. Rao,Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus.Science, 2020.368(6492): p. 779-782.
2. Yan, L., Y. Zhang, J. Ge, L. Zheng, Y. Gao, T. Wang, Z. Jia, H. Wang, Y. Huang, M. Li, Q. Wang, Z. Rao and Z. Lou,Architecture of a SARS-CoV-2 mini replication and transcription complex.Nat Commun, 2020.11(1): p. 5874.
3. Yan, L., J. Ge, L. Zheng, Y. Zhang, Y. Gao, T. Wang, Y. Huang, Y. Yang, S. Gao, M. Li, Z. Liu, H. Wang, Y. Li, Y. Chen, L.W. Guddat, Q. Wang, Z. Rao and Z. Lou,Cryo-EM Structure of an Extended SARS-CoV-2 Replication and Transcription Complex Reveals an Intermediate State in Cap Synthesis.Cell, 2020.
4. Jin, Z., X. Du, Y. Xu, Y. Deng, M. Liu, Y. Zhao, B. Zhang, X. Li, L. Zhang, C. Peng, Y. Duan, J. Yu, L. Wang, K. Yang, F. Liu, R. Jiang, X. Yang, T. You, X. Liu, X. Yang, F. Bai, H. Liu, X. Liu, L.W. Guddat, W. Xu, G. Xiao, C. Qin, Z. Shi, H. Jiang, Z. Rao and H. Yang,Structure of M(pro) from SARS-CoV-2 and discovery of its inhibitors.Nature, 2020.582(7811): p. 289-293.
5. Wang, Q., J. Wu, H. Wang, Y. Gao, Q. Liu, A. Mu, W. Ji, L. Yan, Y. Zhu, C. Zhu, X. Fang, X. Yang, Y. Huang, H. Gao, F. Liu, J. Ge, Q. Sun, X. Yang, W. Xu, Z. Liu, H. Yang, Z. Lou, B. Jiang, L.W. Guddat, P. Gong and Z. Rao,Structural Basis for RNA Replication by the SARS-CoV-2 Polymerase.Cell, 2020.182(2): p. 417-428.e13.
點評一:鐘南山,中國工程院院士
從“非典”到“新冠”,科學依靠堅守
基礎研究是科技創(chuàng)新的源頭,是人類認識自然、適應和改造自然的知識源泉,需要科學家長期的堅守和耕耘。
自2003年“非典”開始,在不到20年的時間里,全球已經(jīng)出現(xiàn)了3次由冠狀病毒導致的傳染病。尤其是此次新冠疫情,在全球已經(jīng)造成超過1億多人感染,而且隨著疫情發(fā)展,突變病毒不斷出現(xiàn),一些已有的中和抗體不能很好的中和突變病毒,部分疫苗針對突變病毒的保護效果也有一定程度下降。深入認識病毒的生命周期,開發(fā)能夠有效應對各種突變病毒的廣譜抗病毒藥物,將成為今后一段時間抗疫工作的重點內(nèi)容之一。
目前針對新冠病毒的抗病毒藥物研究,主要針對的是病毒轉(zhuǎn)錄復制過程的關鍵靶點蛋白,如蛋白酶和聚合酶等。針對這兩個靶點的抑制劑已有相當數(shù)量的進入臨床實驗,例如瑞德西韋(Remdesivir)等。以瑞德西韋為代表的核苷類抗病毒藥物主要作用于病毒的聚合酶,在被摻入產(chǎn)物核酸鏈后,阻斷病毒核酸的合成,進而抑制病毒的轉(zhuǎn)錄復制過程。然而,在此類抑制劑進入臨床研究后,其抗病毒效果與預期有一定差距。除藥物代謝等問題外,冠狀病毒通過特有的“復制矯正”(proofreading)機制逃逸核苷類抗病毒藥物的抑制,可能是此類抗病毒藥物抑制效果不佳的一個重要原因,目前僅有NHC及其衍生物能夠躲避病毒復制矯正機制的干擾。對這個機制開展深入研究,將為今后發(fā)展廣譜、高效的抗冠狀病毒藥物提供關鍵的科學信息。
子和教授及其團隊在新冠疫情爆發(fā)后,針對新冠病毒轉(zhuǎn)錄復制機制開展了系統(tǒng)研究,先后闡明了“核心轉(zhuǎn)錄復制復合體”(C-RTC)[1]、“延伸轉(zhuǎn)錄復制復合體”(E-RTC)[2]和“加帽中間態(tài)轉(zhuǎn)錄復制復合體”[Cap(-1)’-RTC][3]的工作機制。在這些工作的基礎上,他們又在世界上第一次成功組裝成含有形式復制矯正功能的nsp14蛋白的超分子機器Cap(0)-RTC。通過結(jié)構(gòu)分析,他們發(fā)現(xiàn)在Cap(0)-RTC形成的同源二聚體中,解旋酶通過自身構(gòu)象改變,引導模板核酸鏈反向移動,引發(fā)產(chǎn)物鏈“回溯”(backtracking)機制,進而將產(chǎn)物鏈3’末端傳輸至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶結(jié)構(gòu)域的反應中心。復制矯正機制是新冠病毒逃逸核苷類抗病毒藥物的關鍵機制,一旦核苷類藥物被加入RNA產(chǎn)物鏈中,在其被聚合酶感知為“錯配堿基”后,立刻會被病毒的復制矯正過程去除,從而喪失抑制活性。他們的研究工作,為我們生動展現(xiàn)了這一過程的可能機制。復制矯正的回溯機制,是從低等到高等生物細胞保證基因復制準確性的重要機制,但在病毒中以往還沒有發(fā)現(xiàn)此類機制。這一研究成果不但發(fā)現(xiàn)病毒中的類似機制,是認識生命進化的重要成果,而且為進一步優(yōu)化和發(fā)展新型核苷類抗病毒藥物提供了關鍵的結(jié)構(gòu)基礎。
子和教授自2003年SARS爆發(fā)后,就一直在冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復制機制研究領域開展工作,至今已堅持了18年。2003年SARS疫情爆發(fā)期間,我當時即已了解子和教授在SARS病毒的一系列成果,智勇教授那時才剛剛開始博士階段的學習。子和教授的研究組在國際上率先解析了SARS-CoV主蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)[4],并研發(fā)了一系列高效抑制劑[5],他們當時在轉(zhuǎn)錄復制復合體上的研究[6]至今仍被國際同行認為是冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復制復合體機制研究的“開篇之作”。這些積累,為新冠疫情爆發(fā)后他們在新冠病毒基礎研究中取得的一系列重要成果奠定了堅實的基礎,通過闡明新冠病毒主蛋白酶和轉(zhuǎn)錄復制復合體多個狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu),為認識該病毒的生命過程、發(fā)展高效抗病毒藥物提供了關鍵信息,先后在Nature[7]、Science[1]、Cell上[3, 8]和NatureCommunications[2]上發(fā)表系列研究論文,是國際上抗新冠藥物靶點研究中最為系統(tǒng)、引用最多的工作之一。
2020年9月11日,習近平總書記在科學家座談會上總結(jié)了新時代科學家精神,強調(diào)要有勇攀高峰、敢為人先的創(chuàng)新精神,追求真理、嚴謹治學的求實精神,淡泊名利、潛心研究的奉獻精神,集智攻關、團結(jié)協(xié)作的協(xié)同精神,甘為人梯、獎掖后學的育人精神。18年來,子和教授的團隊中有100多人先后參與冠狀病毒研究,累計發(fā)表50余篇研究論文,引用超過6000余次,均篇引用超過100次,一批早期參與的俊彥陸續(xù)成長為國家科研骨干??茖W依靠堅守,子和教授團隊在冠狀病毒的奮斗歷程,對科學家精神做了一個很好的詮釋。
點評二:康樂,中國科學院院士
從結(jié)構(gòu)生物學角度認識新冠病毒的轉(zhuǎn)錄復制機制
新冠病毒造成的疫情,是近一個世紀以來人類面對的最大的一次公共衛(wèi)生事件,深入研究病毒生命周期的分子機制,是認識病毒特征、研發(fā)抗病毒手段的關鍵所在。新冠病毒非常特殊,它的基因組是目前已知RNA病毒中基因組最大的一種,其生命過程所涉及的分子機制也非常復雜。新冠病毒通過兩個機制保證蛋白質(zhì)翻譯和相對準確的轉(zhuǎn)錄復制過程,一是要在病毒mRNA前端加上一個帽結(jié)構(gòu)(cap),用于維持mRNA的穩(wěn)定性和蛋白翻譯的有效進行;二是通過一個獨特的“復制矯正”(proofreading)機制,對病毒基因組的復制實施控制,一旦發(fā)現(xiàn)核酸中的錯配堿基,隨時進行修正。病毒轉(zhuǎn)錄復制復合體上的nsp14蛋白參與了這兩個關鍵過程,可通過其C端的N7甲基化酶完成mRNA加帽過程的第三步催化反應,同時還可通過其N端的外切核酸酶完成復制矯正過程。這一現(xiàn)象在“非典”病毒(SARS-CoV)即已發(fā)現(xiàn),但20年來一直無法回答兩個截然不同的過程如何由一個蛋白來協(xié)同執(zhí)行,是冠狀病毒研究領域中多年來關注的核心基礎生物學問題之一。
清華大學饒子和教授、婁智勇教授團隊與上海科技大學合作在Cell發(fā)表的這一工作,解析了兩種不同狀態(tài)的“Cap(0)轉(zhuǎn)錄復制復合體”Cap(0)-RTC的三維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄復制復合體中,病毒編碼的nsp9蛋白發(fā)揮了“適配器”(adaptor)的作用,將nsp10/nsp14形成的復合體招募到聚合酶上,與聚合酶上的NiRAN結(jié)構(gòu)域共同形成一個“共轉(zhuǎn)錄加帽復合體”(Co-transcriptional Capping Complex, CCC),展示了mRNA加帽過程中,mRNA 5’端在多個關鍵酶分子之間的傳輸路徑,第一次明確揭示了基因組超大的RNA病毒是如何將以聚合酶為中心的“延伸復合體”(Elongation Complex, EC)與“加帽復合體”連接起來。更加重要的是,他們在研究中發(fā)現(xiàn)Cap(0)轉(zhuǎn)錄復制復合體在溶液狀態(tài)下會形成穩(wěn)定的同源二聚體,通過深入研究該二聚體的結(jié)構(gòu),提出了冠狀病毒復制矯正中稱之為反式回溯(in transbacktracking)的機制。進一步的研究發(fā)現(xiàn),在二聚體中,一個Cap(0)轉(zhuǎn)錄復制復合體的聚合酶催化中心與另一個Cap(0)轉(zhuǎn)錄復制復合體的nsp14外切核酸酶結(jié)構(gòu)域催化中心相對,使合成的產(chǎn)物RNA 3’末端能夠通過回溯的方式傳輸?shù)絥sp14外切核酸酶結(jié)構(gòu)域進行加工。同時,他們還發(fā)現(xiàn)解旋酶nsp13的1B結(jié)構(gòu)域發(fā)生了重大構(gòu)象變化,并通過與模板核酸鏈的作用,引導模板核酸鏈反向移動,引發(fā)產(chǎn)物鏈回溯機制。值得指出的是,通過回溯的方式進行復制矯正,在真核/原核細胞中廣泛存在,但是在病毒中還是第一次觀察到此類機制。雖然該過程與真核/原核細胞Pol II轉(zhuǎn)錄過程的復制矯正機制具有一定類似性,但在Pol II的研究中,并未觀測到蛋白具有巨大的構(gòu)象變化,因而Pol II中回溯的驅(qū)動力也不是十分明確,而該工作表明解旋酶通過構(gòu)象變化提供了回溯的驅(qū)動力,為深入理解這一基礎生物學過程提供了重要范例。
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