清華大學陳春來和劉俊杰課題組共同揭示spCas9蛋白搜索靶點的分子機制模型
CIRSPR/Cas9是一種在單條guide RNA（gRNA）的指導下利用Cas9核酸酶對靶標DNA進行特異性識別和切割的技術。該過程涉及到Cas9/gRNA與雙鏈DNA（dsDNA）非特異性的結合、在dsDNA上搜索并識別PAM位點、通過與PAM上游的同源匹配形成RNA/DNA異源雙鏈從而實現(xiàn)在dsDNA上靶點區(qū)域的特異性結合和切割。由于Cas9可以高效快捷地靶向并切割dsDNA，因而被廣泛地應用于基因編輯、基因表達調(diào)控、基因定位和成像等領域。但是，Cas9如何在大量DNA中快速定位其靶標尚不清楚。盡管有研究報道了Cas9在低鹽濃度下利用三維和一維擴散模式搜索靶點，但缺乏闡釋其在生理鹽濃度下靶標搜尋這一動態(tài)過程的結構生物學基礎和分子定量模型。
2021年8月20日，清華大學生命科學學院陳春來和劉俊杰課題組合作在《化學科學》（Chemical Science）雜志發(fā)表了題目為“spCas9與PAM下游DNA位點的非特異性相互作用加速其靶點搜索過程（Nonspecific interactions between SpCas9 and dsDNA sites located downstream of the PAM mediate facilitated diffusion to accelerate target search）” 的研究論文。該論文揭示了在生理鹽濃度下，spCas9利用三維和一維擴散實現(xiàn)高效搜索靶點，其1151-1156位的賴氨酸殘基與PAM下游 ~ 8 bp DNA位點的非特異性結合是介導一維擴散并造成PAM側翼不對稱一維搜索的主要原因。該文揭示了spCas9在生理鹽濃度下的獨特搜索靶點機制和相應的結構生物學基礎，為Cas9體內(nèi)和體外的應用提供了重要指導。
結合生化實驗與單分子熒光技術，該研究發(fā)現(xiàn)，在生理鹽濃度下，spCas9利用三維和一維擴散實現(xiàn)快速搜尋靶點。spCas9的一維擴散以PAM位點為中心展現(xiàn)出了不對稱的搜索區(qū)域（從PAM上游 ~ 10 bp到PAM下游 ~ 30 bp），將靶標搜索效率提高了10倍以上。同時，結合Cas9/gRNA/DNA二聚體的單顆粒冷凍電鏡結構和單分子熒光實驗進一步揭示，PAM下游的~ 8 bp DNA位點與Cas9的1151-1156位賴氨酸殘基（尤其是1153位賴氨酸）之間的存在緊密的非特異性相互作用，是介導Cas9一維擴散并導致PAM側翼的不對稱搜索區(qū)域的主要原因。而通過改變Cas9與DNA的相互作用，包括突變1151-1156位賴氨酸殘基、降低緩沖體系的鹽濃度以及改變PAM識別殘基，都會影響其一維擴散的過程。
最后，該研究提出了spCas9搜索靶點的詳細分子模型（圖1）：在生理鹽濃度下，溶液中自由擴散的Cas9/gRNA復合物通過三維隨機碰撞與dsDNA相互作用。一旦通過1151-1156位賴氨酸殘基與dsDNA非特異性相互作用，spCas9就會瞬時結合并沿dsDNA雙螺旋進行~ 20 bp的一維擴散以尋找PAM位點。一旦搜索到同源靶標就會結合形成復合物，否則會被釋放進入溶液并重新進入搜索過程。spCas9通過與PAM下游區(qū)域的非特異性結合使靶標搜索速率提高了10倍以上，該研究為spCas9 的靶標位點設計提供了重要指導。
清華大學生命科學學院陳春來研究員與劉俊杰研究員為本文共同通訊作者。清華大學生命科學學院CLS項目已畢業(yè)博士生楊夢銥（現(xiàn)為首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院營養(yǎng)與發(fā)育研究室研究實習員）為本文第一作者。生命學院17級博士生孫瑞瑞、結構生物學高精尖創(chuàng)新中心卓越學者鄧譜涓, 醫(yī)學院CLS項目17級博士生楊宇卓、王文娟高級工程師參與了本項目研究。本工作獲得了北京結構生物學高精尖創(chuàng)新中心、北京市生物結構前沿研究中心、清華-北大生命科學聯(lián)合中心及國家自然科學基金委的經(jīng)費支持。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1039/D1SC02633J
課題組相關論文鏈接：
https://doi.org/10.1073/pnas.2002971117
https://doi.org/10.1016/j.isci.2019.08.005
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.12.048
圖1. spCas9蛋白搜索靶標DNA的分子機制模型
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