夏寧邵教授團隊提出一種新型嵌合多肽生物大分子入胞遞送系統(tǒng)
疾病的發(fā)生發(fā)展通常與細(xì)胞內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)異常相關(guān)，利用藥物靶向調(diào)節(jié)相應(yīng)的關(guān)鍵分子或功能途徑進行干預(yù)是基礎(chǔ)研究和臨床治療的重要手段。傳統(tǒng)小分子藥物的作用靶標(biāo)必須具備特殊的“疏水口袋”，導(dǎo)致僅有部分（20%）靶標(biāo)蛋白可用于小分子藥物的研究，相比之下生物大分子藥物（如蛋白質(zhì)、抗體、核酸等）在識別的靶分子類型上幾乎沒有限制，并且在靶向特異性及藥效上也獨具優(yōu)勢，這使其成為藥物研發(fā)最具前景而又競爭激烈的領(lǐng)域之一。目前的生物大分子藥物主要是針對胞外或膜上靶標(biāo)，然而，70%的藥物潛在靶標(biāo)是位于細(xì)胞內(nèi)部的，細(xì)胞膜的選擇通透性導(dǎo)致生物大分子難以企及這個巨大的藥物寶庫。因此，如何有效地將生物大分子遞送到細(xì)胞內(nèi)部成為生物大分子治療以及基礎(chǔ)生物學(xué)研究的當(dāng)務(wù)之急。細(xì)胞穿膜肽（Cell penetrating peptides, CPPs），可介導(dǎo)生物大分子入胞，并且具有生物相容性高、操作簡便、毒副作用低等優(yōu)勢，是目前生物大分子遞送領(lǐng)域的研究熱點之一。但是，CPPs仍面臨著遞送效率低以及體內(nèi)應(yīng)用時血清耐受性差等問題，這也導(dǎo)致在開展CPPs研究后的三十多年間，還未有基于CPPs的臨床藥物獲批上市。夏寧邵團隊提出了一種新型的嵌合多肽生物大分子入胞遞送系統(tǒng)，克服了上述CPPs在應(yīng)用中的瓶頸，并將其成功用于小鼠急性肝損傷體內(nèi)治療模型中。
該研究團隊首先著力于解決CPPs遞送效率低的問題，尤其是內(nèi)吞小泡逃逸效率低的問題（90%-99%的CPPs無法從內(nèi)吞小泡中逃逸，導(dǎo)致其最終在溶酶體中降解（圖.1a））。此前，有研究顯示pH敏感肽的酸化變構(gòu)可破壞內(nèi)吞小泡囊膜，因此常被用于提升CPPs的內(nèi)吞小泡逃逸效率，但由于CPPs、pH敏感肽與囊膜之間較強的粘附作用，被轉(zhuǎn)運的蛋白貨物分子大部分仍無法從內(nèi)吞小泡中成功逃逸（圖.1b）。該團隊從研究最為深入的細(xì)胞穿膜肽TAT入手，在TAT+pH敏感肽（INF7）基礎(chǔ)上，創(chuàng)新性地引入內(nèi)吞小泡特異性蛋白酶酶切位點，利用內(nèi)吞小泡內(nèi)蛋白酶的酶切作用，促使貨物分子與遞送系統(tǒng)分離，從而有效地提高了內(nèi)吞小泡逃逸效率（例如以GFP為貨物分子時，內(nèi)吞小泡逃逸效率可提高4～5倍）（圖.1c）。另一方面，血清耐受性差嚴(yán)重影響著CPPs系統(tǒng)的體內(nèi)應(yīng)用。研究人員發(fā)現(xiàn)血清中大量的帶有負(fù)電性的蛋白（如白蛋白）會與帶有正電荷的CPPs結(jié)合，從而影響CPPs與細(xì)胞膜接觸，最終抑制CPPs的遞送。該研究團隊引入多聚化結(jié)構(gòu)域（如亮氨酸拉鏈，Leu-zipper）形成多價CPPs系統(tǒng)，克服了血清中的主要成分白蛋白對遞送過程的影響，在一定程度上解決了血清耐受性差的問題（圖.1e）。最終，將上述兩種策略聯(lián)用構(gòu)建的嵌合肽eTAT（enhanced TAT）遞送系統(tǒng)，同時擁有高效的遞送效率（例如eTAT介導(dǎo)的GFP入胞效率相較于TAT介導(dǎo)提高了12倍）以及良好的血清耐受程度，展現(xiàn)出其在體內(nèi)的應(yīng)用潛力（圖.1d）。
圖1. eTAT與其它基于TAT的遞送系統(tǒng)的比較
隨后，該研究團隊以細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)細(xì)胞壞死途徑的RIP3蛋白為藥物靶標(biāo)，將eTAT系統(tǒng)與功能性蛋白Ppm1b融合表達組成治療性分子eTAT-Ppm1b，用于小鼠急性肝損傷的治療。APAP（對乙酰氨基酚，泰諾?）是目前世界范圍內(nèi)最常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，但其過量使用會通過RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡途徑引起急性肝臟損傷甚至死亡。此前，有研究顯示Ppm1b可使位于胞內(nèi)靶標(biāo)RIP3去磷酸化從而阻斷壞死性凋亡途徑。該研究團隊將eTAT-Ppm1b重組蛋白尾靜脈注射小鼠，結(jié)果顯示eTAT-Ppm1b將APAP導(dǎo)致的小鼠死亡率從100%降至40%，效果顯著優(yōu)于目前FDA批準(zhǔn)的唯一一款針對該疾病的藥物NAC（死亡率80 %）。
eTAT作為一種通用型的遞送系統(tǒng)，只需與不同的功能蛋白質(zhì)結(jié)合，即可實現(xiàn)相應(yīng)胞內(nèi)靶標(biāo)的干預(yù)及功能調(diào)節(jié)，達到治療相關(guān)疾病的目的。例如，eTAT系統(tǒng)與核酸結(jié)合蛋白融合，可介導(dǎo)mRNA、DNA形式的生物大分子入胞并表達，從而補充功能喪失或在生理水平上表達缺陷的基因或者誘導(dǎo)機體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答，同時也可介導(dǎo)小干擾RNA（siRNA）入胞實現(xiàn)疾病相關(guān)基因表達的下調(diào)；eTAT與基因編輯工程酶（如CRISPR/Cas9）結(jié)合，實現(xiàn)對疾病相關(guān)基因的操縱以達到治療效果?？傊?，該研究不僅為生物大分子的胞內(nèi)遞送提供新的策略，而且為針對胞內(nèi)靶標(biāo)的蛋白藥物的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
近日，相關(guān)研究成果以題為“Efficient intracellular delivery of proteins by a multifunctional chimaeric peptide in vitro and in vivo”的論文在線發(fā)表于《自然?通訊》（Nature Communications）。博士生于思遠、博士生楊晗、高級工程師李廷棟、博士生潘海峰為該論文的共同第一作者。夏寧邵教授、葛勝祥教授、袁權(quán)教授為該論文的共同通訊作者。該研究獲得科技部國家重點研發(fā)計劃、福建省自然科學(xué)基金重點項目、國家自然科學(xué)基金的資助。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-25448-z
（圖/文國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心）
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