環(huán)肽分子生物合成-馬明團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)第一個(gè)催化異構(gòu)化/環(huán)化雙功能硫酯酶并解析其晶體結(jié)構(gòu)
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2021年9月7日，北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室馬明研究團(tuán)隊(duì)在美國化學(xué)會(huì)《ACS Catalysis》上發(fā)表了題為“Functional characterization and crystal structure of the bifunctional thioesterase catalyzing epimerization and cyclization in skyllamycin biosynthesis”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)了環(huán)肽分子生物合成中第一個(gè)催化異構(gòu)化和環(huán)化的雙功能硫酯酶，解析其晶體結(jié)構(gòu)并闡明了其活性位點(diǎn)關(guān)鍵殘基。
D構(gòu)型氨基酸不是蛋白質(zhì)的組成成分，但在天然肽類小分子中卻是重要的結(jié)構(gòu)單元。尤其在非核糖體肽類天然產(chǎn)物中，D構(gòu)型氨基酸是其生物合成中的特征原料砌塊（building block）。D構(gòu)型氨基酸的存在不僅可以提供對(duì)蛋白酶水解的抗性、提供生物合成時(shí)序控制所需的立體結(jié)構(gòu)限制，而且有的對(duì)化合物的生物活性至關(guān)重要。
在非核糖體肽生物合成中，自然界已經(jīng)進(jìn)化出幾種酶來引入D構(gòu)型氨基酸。而與這些已知的酶不同，馬明研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)催化異構(gòu)化和環(huán)化雙功能的硫酯酶Skyxy-TE，該酶能產(chǎn)生含有D構(gòu)型氨基酸殘基的環(huán)肽分子。研究團(tuán)隊(duì)首先從一株海洋鏈霉菌Streptomyces sp. PKU-MA01239（來自于課題組構(gòu)建的海洋細(xì)菌菌種庫）中發(fā)現(xiàn)了非核糖體肽skyllamycin B，該類化合物為含有11個(gè)氨基酸殘基的環(huán)肽分子，具有血小板生長因子抑制活性和抗生物膜活性。通過對(duì)Streptomyces sp. PKU-MA01239基因組測(cè)序確定了skyllamycin B的生物合成基因簇。Skyllamycin B中含有1個(gè)D構(gòu)型羥基取代亮氨酸，推測(cè)其來自于非核糖體肽合成酶（NRPS）裝配線最后一個(gè)硫酯酶功能域Skyxy-TE的催化。體外酶催化表明Skyxy-TE可以將鏈狀底物類似物（來自于固相多肽合成）C末端L-亮氨酸殘基異構(gòu)化為D-亮氨酸，繼而催化分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)形成環(huán)肽產(chǎn)物。有意思的是如果把底物類似物C末端的L-亮氨酸換成L-丙氨酸（側(cè)鏈只含有一個(gè)甲基），Skyxy-TE仍然可以催化L-丙氨酸的異構(gòu)化產(chǎn)生含有D-丙氨酸的環(huán)化產(chǎn)物。
圖1. 硫酯酶Skyxy-TE催化的異構(gòu)化/環(huán)化反應(yīng)
研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)而解析了Skyxy-TE的2.25埃分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Skyxy-TE具有特異的活性中心，其活性中心由于兩個(gè)殘基（Q125和F202）的存在，使其比目前已知7個(gè)NRPS硫酯酶（I型）結(jié)構(gòu)具有更狹窄的活性位點(diǎn)。點(diǎn)突變及體外酶催化表明Skyxy-TE-Q125A突變體失去了異構(gòu)化的立體選擇性，產(chǎn)生了沒有異構(gòu)化的含有L-亮氨酸殘基的環(huán)化產(chǎn)物；而Skyxy-TE-F202A突變體則基本喪失了環(huán)化功能，產(chǎn)生了水解鏈狀產(chǎn)物。
圖2. 硫酯酶Skyxy-TE的晶體結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)以及突變體催化的反應(yīng)
硫酯酶功能域催化環(huán)化或者水解反應(yīng)已經(jīng)很早就得到了充分闡明，本研究對(duì)Skyxy-TE異構(gòu)化/環(huán)化的功能的表征進(jìn)一步擴(kuò)展了非核糖體肽合成酶（NRPS）“多才多藝”的認(rèn)識(shí)。同時(shí)本研究對(duì)Skyxy-TE晶體結(jié)構(gòu)的解析和關(guān)鍵殘基的闡明有利于該酶在化學(xué)-酶聯(lián)催化方面的應(yīng)用，以進(jìn)行D或L構(gòu)型控制的多種環(huán)肽分子的制備。
該項(xiàng)工作得到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“深海關(guān)鍵技術(shù)與裝備”項(xiàng)目“重要深海藥源天然產(chǎn)物合成生物學(xué)產(chǎn)生體系構(gòu)建”、國家自然科學(xué)基金委等資助。北京大學(xué)藥學(xué)院博士后于佳慧、博士生宋娟為本論文共同第一作者，北京大學(xué)藥學(xué)院馬明研究員為通訊作者。感謝北京大學(xué)藥學(xué)院林文翰教授在海洋天然產(chǎn)物研究和菌種庫構(gòu)建方面的長期支持，感謝董甦偉研究員在固相多肽合成、張亮仁教授在分子對(duì)接方面的支持！
第一作者：
原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acscatal.1c03064
通訊作者簡介：
馬明，北京大學(xué)藥學(xué)院、天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員，博士生導(dǎo)師，Tenure-Track助理教授。研究領(lǐng)域?yàn)樘烊凰幱霉δ芊肿拥纳锖铣?，酶的三維結(jié)構(gòu)及其催化機(jī)制，以及天然產(chǎn)物合成生物學(xué)。近5年以通訊作者在JACS、ACS Catal.、Chem. Sci.、Commun. Chem.、Org. Lett.、J. Biol. Chem.、J. Org. Chem.、J. Nat. Prod.、Chin. J. Chem.、Appl. Microbiol. Biotechnol.、ACS Omega、Mar. Drug等國際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文10余篇。任中國藥學(xué)會(huì)海洋藥物專業(yè)委員會(huì)委員、中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)青年委員會(huì)委員、北京藥學(xué)會(huì)天然藥物專業(yè)委員會(huì)委員。
天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 供稿
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