林金星教授團隊在植物膜蛋白動態(tài)計算方面發(fā)表高質(zhì)量綜述論文
近日，北京林業(yè)大學林木分子設(shè)計育種高精尖創(chuàng)新中心和生物學院林金星教授受邀在植物學權(quán)威學術(shù)期刊Annual Review of Plant Biology撰寫題為 “Exploring the Spatiotemporal Organization of Membrane Proteins in Living Plant Cells”的綜述文章 (IF=22.8)，對在活體狀態(tài)下植物膜蛋白動態(tài)、聚合狀態(tài)及蛋白互作的單分子分析技術(shù)進行了總結(jié)，對這些單分子分析技術(shù)在植物生物學中的應(yīng)用進行了深入探討，并提出了有效的分析方法。
植物膜蛋白在物質(zhì)轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮重要作用，但在活體條件下研究和分析膜蛋白的動態(tài)過程、分子間相互作用則非常困難。林金星教授研究團隊率先建立了適合于植物活細胞觀察的單分子分析平臺，實現(xiàn)了在體、原位條件下膜蛋白聚合狀態(tài)以及蛋白互作的納米和毫秒級的實時動態(tài)檢測。十多年來，通過單分子技術(shù)相繼對植物中的PIP2;1 (Li et al., Plant Cell, 2011), Flot1 (Li et al., Plant Cell, 2012), AMT1;3 (Wang et al., PNAS, 2013), AP2 σ (Fan et al., Development, 2013), Phot1 (Wan et al., Plant Cell, 2014), RbohD (Hao et al., Plant Cell, 2014), BRI1 (Wang et al., Molecular Plant, 2015) 等膜蛋白的擴散和駐留時間等動態(tài)參數(shù)進行了檢測和分析。此外, 還通過優(yōu)化單分子技術(shù)，分析了活體狀態(tài)下膜蛋白的聚合狀態(tài) (Wang et al., Nature Protocols, 2015)，并建立了一些重要細胞器膜蛋白的單分子檢測技術(shù)方法 (Lv et al., Molecular Plant, 2017)。在過去這些研究的基礎(chǔ)上，該綜述著重分四部分評述了植物膜蛋白單分子研究技術(shù)，包括標記技術(shù)、單分子成像技術(shù)、膜蛋白聚合體和互作的動態(tài)計算方法，以及這些技術(shù)在植物生物學領(lǐng)域的應(yīng)用。
由于單個分子的熒光很弱，并且容易受到背景噪音的干擾，因此要實現(xiàn)單分子成像，對膜蛋白進行有效標記至關(guān)重要。該綜述的第一部分除了介紹常規(guī)的標記方法，譬如小分子染料和納米熒光顆粒標記(量子點QD)等技術(shù)外，還重點敘述了熒光蛋白的標記(如GFP、mCherry、DsRed-E5、光激活蛋白PA-GFP和Dronpa)，以及它們在實際應(yīng)用中需要注意的問題。
第二部分闡述了標記后蛋白的單分子追蹤和成像技術(shù)，包括激光共聚焦顯微鏡、超高分辨顯微鏡和寬場顯微鏡等。雖然常規(guī)的共聚焦顯微鏡的分辨率不能達到單分子檢測要求，但如果配置高靈敏度的檢測器，結(jié)合相應(yīng)的分析系統(tǒng)，譬如熒光相關(guān)光譜(FCS)、熒光互相關(guān)光譜(FCCS)和熒光能量共振偏移(FRET)技術(shù)等，也可以實現(xiàn)對單分子的追蹤、動態(tài)分析以及膜蛋白狀態(tài)的檢測。該綜述除了介紹2014年諾貝爾化學獎授予的超分辨顯微術(shù)(STED、STORM、PALM等)以外，重點介紹了適合于植物細胞膜蛋白分析的可變角度-全內(nèi)反射熒光顯微鏡(VA-TIRFM)的原理及其應(yīng)用。
綜述的第三部分詳細介紹了在標記和成像基礎(chǔ)上，測定膜蛋白聚合狀態(tài)和動力學特征的主要方法：(1)通過熒光強度的分析技術(shù)，包括FIDA、PCH、SpIDA技術(shù)；(2)通過熒光漂白的分析技術(shù)，包括smSubunit-counting和smFRAP技術(shù)；(3)通過熒光漲落及熒光共振能量轉(zhuǎn)移的分析技術(shù)，包括FCS/FCCS、FRET-FLIM技術(shù)；(4)通過蛋白共定位和相互作用的分析技術(shù)，包括單分子水平的蛋白接近指數(shù)分析技術(shù)(smPPI)和單分子水平的pull-down 技術(shù)。
圖1植物細胞中膜蛋白聚合狀態(tài)的動態(tài)計算技術(shù)模式圖
綜述的最后一部分簡要敘述了在信號傳導過程中，單分子技術(shù)用于檢測膜蛋白聚合與活化狀態(tài)、動態(tài)變化與膜筏關(guān)系、動力學特征與細胞骨架關(guān)系，以及不同環(huán)境條件下膜蛋白密度、駐留時間、胞吞途徑和轉(zhuǎn)運速率、細胞骨架和細胞壁對膜蛋白聚合體形成的動態(tài)調(diào)控等方面的應(yīng)用，為植物膜蛋白的研究提供了新思路。
該綜述已于4月6日在線發(fā)表(https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-042817-040233)。林金星教授為論文的通訊作者，該團隊成員、現(xiàn)為揚州大學副教授王莉為論文的第一作者，團隊成員薛軼群、邢晶晶和宋凱博士為論文的其他作者。該論文得到了北京林木分子設(shè)計育種高精尖創(chuàng)新中心和國家自然科學基金重點項目的資助。
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