最新研究成果 | 中藥冬凌草甲素為攻克白血病提供新思路 | 清華大學(xué)藥學(xué)院王建偉團(tuán)隊(duì)DNMT3A突變驅(qū)動(dòng)衰老相關(guān)克隆性造血及小分子抑制劑
時(shí)間：2021-10-23 09:41:02學(xué)院：藥學(xué)院學(xué)校：清華大學(xué)
近日，清華大學(xué)藥學(xué)院王建偉團(tuán)隊(duì)分別在藥學(xué)專業(yè)期刊《Acta Pharmaceutica Sinica B》發(fā)表題為“Aging-elevated inflammation promotes DNMT3A R878H-driven clonal hematopoiesis”的研究論文，在細(xì)胞死亡領(lǐng)域?qū)I(yè)期刊《Cell Death Discovery》發(fā)表題為“Oridonin inhibits DNMT3A R882 mutation-driven clonal hematopoiesis and leukemia by inducing apoptosis and necroptosis”的研究論文。兩篇文章解析了衰老進(jìn)程中DNMT3A hR882H/mR878H突變導(dǎo)致造血干細(xì)胞克隆性增生的分子生物學(xué)機(jī)制，并篩選出冬凌草甲素能夠選擇性的抑制攜帶DNMT3A R882突變的造血干細(xì)胞的克隆性造血能力以及急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的成瘤能力。
研究背景
part 1
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克隆性造血屬于血液腫瘤的癌前病變狀態(tài)，它具有以下四個(gè)特點(diǎn)：血液細(xì)胞攜帶白血病相關(guān)基因的突變、且突變頻率大于2%、這些突變主要擴(kuò)增造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cell, HSC）及祖細(xì)胞、攜帶這些突變的病人還沒(méi)有轉(zhuǎn)化為白血病。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，克隆性造血會(huì)隨著個(gè)體的衰老而不斷加劇，因而也被稱為衰老相關(guān)克隆性造血?？寺⌒栽煅膫€(gè)體發(fā)生白血病的風(fēng)險(xiǎn)較正常人增加了10倍，并出現(xiàn)髓系細(xì)胞分化偏向性，從而導(dǎo)致系統(tǒng)性慢性炎癥，進(jìn)而使得炎癥相關(guān)疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死以及中風(fēng)的發(fā)生率提高了約1倍。而全身性的慢性炎癥反過(guò)來(lái)加劇克隆性造血的進(jìn)展，從而形成一個(gè)惡性循環(huán)（圖1）。
克隆性造血發(fā)生率隨著年齡增大而增加，并伴隨著很多關(guān)鍵基因的突變，其中DNMT3A在多個(gè)研究中都顯示為突變頻率最高的基因。DNMT3A可測(cè)到的突變位點(diǎn)多達(dá)190個(gè)，其中R882位點(diǎn)突變?cè)诳寺⌒栽煅獋€(gè)體中占17%，在急性髓系白血?。ˋML）個(gè)體中占比高達(dá)50%。由于克隆性造血為白血病的癌前病變狀態(tài)，由此說(shuō)明攜帶R882突變的克隆性造血患者更容易轉(zhuǎn)化為白血病。此外，攜帶DNMT3A突變的白血病病人生存率明顯下降，這種不良的預(yù)后主要與DNMT3A突變細(xì)胞對(duì)臨床常用的蒽環(huán)類化療藥產(chǎn)生耐藥性相關(guān)。那么，DNMT3A 突變頻率隨著衰老不斷增加的分子機(jī)制是什么？是否存在針對(duì)DNMT3A突變細(xì)胞的小分子抑制劑？
DNMT3A突變引發(fā)衰老相關(guān)克隆性造血的分子機(jī)制研究
1.? 衰老的骨髓促進(jìn)DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
我們分別將年輕的R878H骨髓細(xì)胞連同正常的競(jìng)爭(zhēng)者骨髓細(xì)胞移植到年輕與年老的受體小鼠中。結(jié)果顯示，R878H骨髓細(xì)胞在年老受體小鼠中重建率更高，而WT細(xì)胞則沒(méi)有明顯差異（圖2），說(shuō)明年老的骨髓微環(huán)境促進(jìn)了R878H誘導(dǎo)的克隆性造血。那么到底是年老骨髓中什么因素促進(jìn)了R878H細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增呢？
圖2 衰老的骨髓促進(jìn)DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
2.? LPS誘導(dǎo)的慢性炎癥促進(jìn)R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
近些年來(lái)，普遍認(rèn)為衰老與炎癥密切相關(guān)，因此有了炎性衰老（Inflamm-aging）的概念。那么，R878H細(xì)胞在年老骨髓中的克隆性擴(kuò)增是否與年老的骨髓炎癥微環(huán)境增強(qiáng)相關(guān)呢？為此，我們分別用LPS模擬急性和慢性炎癥刺激。發(fā)現(xiàn)R878H HSC對(duì)于急性炎癥刺激的響應(yīng)明顯下降，而慢性炎癥刺激可以促進(jìn)R878H細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的克隆性造血（圖3）。
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圖3 LPS誘導(dǎo)的慢性炎癥促進(jìn)R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
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圖6 DNMT3A R882H細(xì)胞系的構(gòu)建及小分子篩選策略
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圖7 冬凌草甲素誘導(dǎo)DNMT3A突變細(xì)胞發(fā)生凋亡與程序性壞死
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圖8 冬凌草甲素誘導(dǎo)R878H HSC發(fā)生凋亡和程序性壞死
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總結(jié)
part 4
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參考文獻(xiàn)：
1. ?Min Liao, Ruiqing Chen, Yang Yang, Hanqing He, Liqian Xu, Yuxuan Jiang, Zhenxing Guo, Wei He, Hong Jiang, Jianwei Wang. Aging-elevated inflammation promotes DNMT3A R878H-driven clonal hematopoiesis. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2021, Doi: ./10.1016/j.apsb.2021.09.015. (in press)
2. ?Min Liao, Dong Qiongye, Ruiqing Chen, Liqian Xu, Yuxuan Jiang, Zhenxing Guo, Min Xiao, Wei He, Changcai Cao, Ronghua Hu, Wanling Sun, Hong Jiang, Jianwei Wang. Oridonin inhibits DNMT3A R882 mutation-driven clonal hematopoiesis and leukemia by inducing apoptosis and necroptosis. Cell Death Discovery. 2021; 7 (1): 297.
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文章鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211383521003579
https://www.nature.com/articles/s41420-021-00697-5#author-information
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研究背景
part 1
克隆性造血屬于血液腫瘤的癌前病變狀態(tài)，它具有以下四個(gè)特點(diǎn)：血液細(xì)胞攜帶白血病相關(guān)基因的突變、且突變頻率大于2%、這些突變主要擴(kuò)增造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cell, HSC）及祖細(xì)胞、攜帶這些突變的病人還沒(méi)有轉(zhuǎn)化為白血病。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，克隆性造血會(huì)隨著個(gè)體的衰老而不斷加劇，因而也被稱為衰老相關(guān)克隆性造血?？寺⌒栽煅膫€(gè)體發(fā)生白血病的風(fēng)險(xiǎn)較正常人增加了10倍，并出現(xiàn)髓系細(xì)胞分化偏向性，從而導(dǎo)致系統(tǒng)性慢性炎癥，進(jìn)而使得炎癥相關(guān)疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死以及中風(fēng)的發(fā)生率提高了約1倍。而全身性的慢性炎癥反過(guò)來(lái)加劇克隆性造血的進(jìn)展，從而形成一個(gè)惡性循環(huán)（圖1）。
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圖1 克隆性造血、慢性炎癥和心管疾病之間的聯(lián)系
圖1 克隆性造血、慢性炎癥和心管疾病之間的聯(lián)系
克隆性造血發(fā)生率隨著年齡增大而增加，并伴隨著很多關(guān)鍵基因的突變，其中DNMT3A在多個(gè)研究中都顯示為突變頻率最高的基因。DNMT3A可測(cè)到的突變位點(diǎn)多達(dá)190個(gè)，其中R882位點(diǎn)突變?cè)诳寺⌒栽煅獋€(gè)體中占17%，在急性髓系白血?。ˋML）個(gè)體中占比高達(dá)50%。由于克隆性造血為白血病的癌前病變狀態(tài)，由此說(shuō)明攜帶R882突變的克隆性造血患者更容易轉(zhuǎn)化為白血病。此外，攜帶DNMT3A突變的白血病病人生存率明顯下降，這種不良的預(yù)后主要與DNMT3A突變細(xì)胞對(duì)臨床常用的蒽環(huán)類化療藥產(chǎn)生耐藥性相關(guān)。那么，DNMT3A 突變頻率隨著衰老不斷增加的分子機(jī)制是什么？是否存在針對(duì)DNMT3A突變細(xì)胞的小分子抑制劑？
DNMT3A突變引發(fā)衰老相關(guān)克隆性造血的分子機(jī)制研究
part 2
?1.? 衰老的骨髓促進(jìn)DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
我們分別將年輕的R878H骨髓細(xì)胞連同正常的競(jìng)爭(zhēng)者骨髓細(xì)胞移植到年輕與年老的受體小鼠中。結(jié)果顯示，R878H骨髓細(xì)胞在年老受體小鼠中重建率更高，而WT細(xì)胞則沒(méi)有明顯差異（圖2），說(shuō)明年老的骨髓微環(huán)境促進(jìn)了R878H誘導(dǎo)的克隆性造血。那么到底是年老骨髓中什么因素促進(jìn)了R878H細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增呢？
圖2 衰老的骨髓促進(jìn)DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
2.? LPS誘導(dǎo)的慢性炎癥促進(jìn)R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
近些年來(lái)，普遍認(rèn)為衰老與炎癥密切相關(guān)，因此有了炎性衰老（Inflamm-aging）的概念。那么，R878H細(xì)胞在年老骨髓中的克隆性擴(kuò)增是否與年老的骨髓炎癥微環(huán)境增強(qiáng)相關(guān)呢？為此，我們分別用LPS模擬急性和慢性炎癥刺激。發(fā)現(xiàn)R878H HSC對(duì)于急性炎癥刺激的響應(yīng)明顯下降，而慢性炎癥刺激可以促進(jìn)R878H細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的克隆性造血（圖3）。
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圖3 LPS誘導(dǎo)的慢性炎癥促進(jìn)R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血
3.? R878H HSC抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷
我們分別取年輕和年老受體小鼠的骨髓上清做細(xì)胞因子芯片分析，發(fā)現(xiàn)其中TNFα信號(hào)通路在年老骨髓中顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H HSC可以抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷（圖4），證明TNFα是年老骨髓微環(huán)境中促進(jìn)R878H細(xì)胞克隆性擴(kuò)增的主要炎癥因子。
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我們分別取年輕和年老受體小鼠的骨髓上清做細(xì)胞因子芯片分析，發(fā)現(xiàn)其中TNFα信號(hào)通路在年老骨髓中顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H HSC可以抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷（圖4），證明TNFα是年老骨髓微環(huán)境中促進(jìn)R878H細(xì)胞克隆性擴(kuò)增的主要炎癥因子。
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圖4 R878H HSC抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷
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圖4 R878H HSC抵抗TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷
4.? Dnmt3a R878H細(xì)胞抵抗細(xì)胞程序性壞死激活
我們將年老受體骨髓中的LSK細(xì)胞分選出來(lái)做RT-PCR，分別檢測(cè)TNFα信號(hào)下游相關(guān)的通路基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)凋亡通路的Fadd和Caspase-8以及細(xì)胞程序性壞死通路的Ripk1和Ripk3表達(dá)下降（圖5），說(shuō)明凋亡和程序性壞死通路在R878H細(xì)胞中受到了抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H細(xì)胞能夠部分抵抗細(xì)胞程序性壞死，而不是凋亡（圖5），說(shuō)明Dnmt3a R878H細(xì)胞通過(guò)抵抗細(xì)胞程序性壞死的激活而獲得增殖優(yōu)勢(shì)。
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我們將年老受體骨髓中的LSK細(xì)胞分選出來(lái)做RT-PCR，分別檢測(cè)TNFα信號(hào)下游相關(guān)的通路基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)凋亡通路的Fadd和Caspase-8以及細(xì)胞程序性壞死通路的Ripk1和Ripk3表達(dá)下降（圖5），說(shuō)明凋亡和程序性壞死通路在R878H細(xì)胞中受到了抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H細(xì)胞能夠部分抵抗細(xì)胞程序性壞死，而不是凋亡（圖5），說(shuō)明Dnmt3a R878H細(xì)胞通過(guò)抵抗細(xì)胞程序性壞死的激活而獲得增殖優(yōu)勢(shì)。
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圖5 Dnmt3a R878H細(xì)胞抵抗細(xì)胞程序性壞死激活
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針對(duì)DNMT3A突變細(xì)胞的小分子抑制劑的研究
part 3
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針對(duì)DNMT3A突變細(xì)胞的小分子抑制劑的研究
part 3
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5.? DNMT3A R882H細(xì)胞系的構(gòu)建及小分子篩選策略
為篩選針對(duì)DNMT3A R882 / Dnmt3a R878突變的小分子抑制劑，我們首先構(gòu)建DNMT3A R882H突變細(xì)胞系，并在該細(xì)胞系的AAVS1位點(diǎn)定點(diǎn)敲入一個(gè)紅色熒光報(bào)告基因tdTomato，同時(shí)在WT細(xì)胞的同樣位點(diǎn)敲入EGFP基因。我們將兩種細(xì)胞按1：1共培養(yǎng)，并加入小分子處理2天后用高通量流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，冬凌草甲素為R882H細(xì)胞的選擇性抑制小分子（圖6）。
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5.? DNMT3A R882H細(xì)胞系的構(gòu)建及小分子篩選策略
為篩選針對(duì)DNMT3A R882 / Dnmt3a R878突變的小分子抑制劑，我們首先構(gòu)建DNMT3A R882H突變細(xì)胞系，并在該細(xì)胞系的AAVS1位點(diǎn)定點(diǎn)敲入一個(gè)紅色熒光報(bào)告基因tdTomato，同時(shí)在WT細(xì)胞的同樣位點(diǎn)敲入EGFP基因。我們將兩種細(xì)胞按1：1共培養(yǎng)，并加入小分子處理2天后用高通量流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，冬凌草甲素為R882H細(xì)胞的選擇性抑制小分子（圖6）。
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圖6 DNMT3A R882H細(xì)胞系的構(gòu)建及小分子篩選策略
6.? 冬凌草甲素誘導(dǎo)DNMT3A突變細(xì)胞發(fā)生凋亡與程序性壞死
冬凌草甲素作用于R882H細(xì)胞的IC50值約為WT細(xì)胞的一半，并且相對(duì)于攜帶其他克隆性造血突變基因的細(xì)胞系，冬凌草甲素對(duì)DNMT3A突變細(xì)胞系（OCI-AML3）的抑制作用呈現(xiàn)選擇性。進(jìn)一步研究表明，冬凌草甲素抑制OCI-AML3細(xì)胞的生長(zhǎng)通過(guò)同時(shí)激活細(xì)胞凋亡與程序性壞死。
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冬凌草甲素作用于R882H細(xì)胞的IC50值約為WT細(xì)胞的一半，并且相對(duì)于攜帶其他克隆性造血突變基因的細(xì)胞系，冬凌草甲素對(duì)DNMT3A突變細(xì)胞系（OCI-AML3）的抑制作用呈現(xiàn)選擇性。進(jìn)一步研究表明，冬凌草甲素抑制OCI-AML3細(xì)胞的生長(zhǎng)通過(guò)同時(shí)激活細(xì)胞凋亡與程序性壞死。
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圖7 冬凌草甲素誘導(dǎo)DNMT3A突變細(xì)胞發(fā)生凋亡與程序性壞死
7.? 冬凌草甲素誘導(dǎo)R878H HSC發(fā)生凋亡和程序性壞死
此外，我們發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能顯著抑制OCI-AML3細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，并且能顯著抑制DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血，而對(duì)WT細(xì)胞沒(méi)有影響（圖8）。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，冬凌草甲素同時(shí)誘導(dǎo)R878H HSC發(fā)生凋亡和程序性壞死。
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此外，我們發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能顯著抑制OCI-AML3細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，并且能顯著抑制DNMT3A R878H驅(qū)動(dòng)的克隆性造血，而對(duì)WT細(xì)胞沒(méi)有影響（圖8）。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，冬凌草甲素同時(shí)誘導(dǎo)R878H HSC發(fā)生凋亡和程序性壞死。
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圖8 冬凌草甲素誘導(dǎo)R878H HSC發(fā)生凋亡和程序性壞死
冬凌草甲素抑制DNMT3A突變驅(qū)動(dòng)的克隆性造血及白血病部分我們已經(jīng)申請(qǐng)了PCT專利一項(xiàng)（專利名稱：Novel Use of Oridonin or Oridonin Derivative；專利申請(qǐng)?zhí)枺篜CT/CN2020/093017）。此外，由于以冬凌草甲素為主要成分的中藥冬凌草已經(jīng)是一個(gè)經(jīng)國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的抗炎中成藥，我們已經(jīng)開(kāi)展臨床試驗(yàn)，將冬凌草片用于DNMT3A突變白血病的研究中。
總結(jié)
part 4
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結(jié)語(yǔ)：這兩篇論文系統(tǒng)性地從DNMT3A R878H小鼠模型的構(gòu)建，到DNMT3A R882突變引發(fā)衰老相關(guān)克隆性造血的機(jī)制研究，再到抑制DNMT3A R882突變驅(qū)動(dòng)的克隆性造血的小分子抑制劑的研究，對(duì)DNMT3A突變及其他相關(guān)突變驅(qū)動(dòng)的克隆性造血及白血病研究具有一定的指導(dǎo)意義，為尋找相關(guān)突變誘發(fā)的白血病與克隆性造血的潛在小分子抑制劑提供了參考。
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王建偉實(shí)驗(yàn)室2017級(jí)博士研究生廖敏為這兩篇文章的獨(dú)立第一作者，第一篇文章中王建偉研究員和浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的姜虹博士為共同通訊作者，第二篇文章中王建偉研究員、浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的姜虹博士和首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院的孫婉玲博士為共同通訊作者。此外，多家單位的多位老師和學(xué)生也給與了很多幫助，在此一并表示感謝。本項(xiàng)目受到了國(guó)家自然科學(xué)基金（81870118，91849106）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFA0104000，2018YFA0800200）、北京市科委項(xiàng)目（Z200022, Z181100001818005）及清華大學(xué)-北京大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心（Tsinghua-Peking Center for Life Sciences）的資助。
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王建偉實(shí)驗(yàn)室2017級(jí)博士研究生廖敏為這兩篇文章的獨(dú)立第一作者，第一篇文章中王建偉研究員和浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的姜虹博士為共同通訊作者，第二篇文章中王建偉研究員、浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的姜虹博士和首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院的孫婉玲博士為共同通訊作者。此外，多家單位的多位老師和學(xué)生也給與了很多幫助，在此一并表示感謝。本項(xiàng)目受到了國(guó)家自然科學(xué)基金（81870118，91849106）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFA0104000，2018YFA0800200）、北京市科委項(xiàng)目（Z200022, Z181100001818005）及清華大學(xué)-北京大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心（Tsinghua-Peking Center for Life Sciences）的資助。
參考文獻(xiàn)：
1. ?Min Liao, Ruiqing Chen, Yang Yang, Hanqing He, Liqian Xu, Yuxuan Jiang, Zhenxing Guo, Wei He, Hong Jiang, Jianwei Wang. Aging-elevated inflammation promotes DNMT3A R878H-driven clonal hematopoiesis. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2021, Doi: ./10.1016/j.apsb.2021.09.015. (in press)
2. ?Min Liao, Dong Qiongye, Ruiqing Chen, Liqian Xu, Yuxuan Jiang, Zhenxing Guo, Min Xiao, Wei He, Changcai Cao, Ronghua Hu, Wanling Sun, Hong Jiang, Jianwei Wang. Oridonin inhibits DNMT3A R882 mutation-driven clonal hematopoiesis and leukemia by inducing apoptosis and necroptosis. Cell Death Discovery. 2021; 7 (1): 297.
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文章鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211383521003579
https://www.nature.com/articles/s41420-021-00697-5#author-information
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