賈桂芳課題組開發(fā)無需抗體的酶輔助化學(xué)標記N6-甲基腺嘌呤（m6A）測序技術(shù)
2020年4月27日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院賈桂芳該課題組在Nature子刊《Nature Chemical Biology》在線發(fā)表了題為“Antibody-free enzyme-assisted chemical approach for detection of N6-methyladenosin”的研究論文，首次報道了利用FTO酶輔助實現(xiàn)了RNA修飾m6A的化學(xué)標記，并成功應(yīng)用于全轉(zhuǎn)錄組m6A的高通量測序。
隨著首個RNA修飾N6-甲基腺嘌呤（m6A）的去修飾酶FTO的發(fā)現(xiàn)，RNA表觀遺傳學(xué)/表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)開始興起并成為表觀遺傳學(xué)新的研究熱點。m6A作為首個被發(fā)現(xiàn)的可逆RNA修飾，廣泛存在于mRNA，依賴修飾酶、去修飾酶和結(jié)合蛋白發(fā)揮調(diào)控功能。已發(fā)現(xiàn)m6A具有調(diào)控mRNA剪接、出核、穩(wěn)定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發(fā)育、配子發(fā)生、細胞重編程、生物節(jié)律、疾病等多種生理和病理過程的功能調(diào)控。為了更好地研究m6A生物功能和臨床病理研究，開發(fā)m6A高通量測序技術(shù)一直是研究的熱點。
現(xiàn)有m6A測序技術(shù)主要依賴于m6A抗體富集技術(shù)，包括低分辨率的m6A-seq/MeRIP-seq和聯(lián)用iCLIP或PAR-CLIP技術(shù)的高分辨率m6A測序技術(shù)miCLIP 或PA-m6A-seq。抗體存在對特定RNA序列或結(jié)構(gòu)的潛在非特異性結(jié)合，為了解決抗體方法的種種問題，研究者們做出了各種嘗試，近期開發(fā)了兩類無需抗體的m6A測序技術(shù)，一類為利用對特定甲基化序列（m6ACA）敏感的RNA核酸內(nèi)切酶MazF輔助的測序方法（m6A-REF-seq or MAZTER-seq），此類方法只能檢測16~25%的m6A位點；另一種是在細胞內(nèi)表達融合m6A-binding domain（YTH）與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）的融合蛋白實現(xiàn)的m6A測序（DART-seq），但該方法依賴于細胞轉(zhuǎn)染效率且受限于體外樣品的使用。
賈桂芳課題組一直致力于開發(fā)和利用核酸化學(xué)生物學(xué)技術(shù)研究RNA化學(xué)修飾在動植物中的生物功能研究。在本課題中，賈桂芳課題組巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作為催化劑，將mRNA上化學(xué)惰性的m6A轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)活性的中間態(tài)產(chǎn)物N6-羥甲基腺嘌呤（hm6A），然后利用二硫蘇糖醇（DTT）的巰基與hm6A發(fā)生亞胺1,2加成反應(yīng)，將不穩(wěn)定的hm6A轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的巰基加成產(chǎn)物dm6A。dm6A上的自由巰基可以與甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反應(yīng)，實現(xiàn)在mRNA上m6A的位置標記生物素Biotin，最終可被鏈霉親和素珠捕獲，從而富集含有m6A修飾的RNA片段供后續(xù)高通量測序使用。此方法被命名為m6A-SEAL（FTO-assisted m6A selective chemical labeling method）（見圖一）。
圖一. m6A-SEAL測序流程圖
他們將m6A-SEAL分別應(yīng)用于人HEK293T細胞和水稻的polyA+ RNA上，實現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組m6A位點檢測。通過該課題組之前開發(fā)的基于qPCR的m6A單位點檢測方法SELECT驗證了多個m6A位點，證明m6A-SEAL作為化學(xué)共價交聯(lián)技術(shù)，要比基于抗體的方法或DART-seq具有更高的可靠性和靈敏度。
FTO除m6A外，還對RNA5’帽位置的N6,2'-O-二甲基腺嘌呤 (cap m6Am）具有催化活性，能將其催化為hm6Am。為了驗證m6A-SEAL測序方法是否還會同時檢測cap m6Am，他們通過體外酶活性實驗和標記實驗發(fā)現(xiàn)目前m6A-SEAL方法中使用的FTO氧化反應(yīng)條件只能特異性將m6A反應(yīng)成hm6A，通過優(yōu)化FTO氧化反應(yīng)條件可以實現(xiàn)m6A-SEAL只針對cap m6Am的標記和測序。
總之，該項研究首次利用FTO酶輔助實現(xiàn)了RNA修飾m6A化學(xué)標記和高通量測序。m6A-SEAL具有高靈敏度和高特異性的特點，可以應(yīng)用于少量mRNA樣品。未來他們將繼續(xù)對m6A-SEAL進行優(yōu)化和改造，以實現(xiàn)單堿基分辨率。由于FTO可以氧化催化RNA的cap m6Am和DNA的N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA），未來m6A-SEAL通過優(yōu)化有望應(yīng)用于這些化學(xué)修飾的測序；同時該方法除了可以在m6A上標記biotin用于富集，還可以標記熒光素，有潛力應(yīng)用于m6A的成像。
賈桂芳實驗室已畢業(yè)的博士研究生王燁為論文的第一作者，已畢業(yè)的博士研究生肖雨、博士后喻瓊和本科生董舜卿為共同作者，賈桂芳研究員為通訊作者。該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金、科技部重點研發(fā)計劃、生物有機與分子工程教育部重點實驗室、北京分子科學(xué)國家研究中心及上海藥物所新藥研究國家重點實驗室開放課題等經(jīng)費的支持。
原文鏈接： https://www.nature.com/articles/s41589-020-0525-x
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