黃碩團(tuán)隊《德國應(yīng)用化學(xué)》: 使用MspA納米孔監(jiān)測蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)換
單通道納米孔分析技術(shù)正在成為無標(biāo)簽實時分析單個蛋白質(zhì)的有力工具。它微秒級的時間尺度非常適合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的高分辨監(jiān)測。通過分析單一的蛋白質(zhì)被捕獲后產(chǎn)生的電流封鎖及其對應(yīng)的事件時間即可實時反映蛋白質(zhì)的活動過程。近年來，一系列生物納米孔例如溶細(xì)胞素A（ClyA），曲霉毒素C（FraC）和胸膜溶素AB（PlyAB）已被證明可用于研究蛋白質(zhì)的多種結(jié)構(gòu)動力學(xué)。這些生物孔道都具有較大容積的空腔可以完全容納蛋白質(zhì)分析物，且都經(jīng)過了一定的工程改造以增加對蛋白質(zhì)的捕獲效率，這對于納米孔自身的形狀和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有較高的要求。?
圖1. MspA對鈣調(diào)素變構(gòu)轉(zhuǎn)換的隨機(jī)傳感示意圖
最近，我院黃碩團(tuán)隊報道了一種新的檢測方案，使用錐形結(jié)構(gòu)的恥垢分枝桿菌膜蛋白A (MspA)作為納米陷阱在部分容納待測蛋白的狀態(tài)下對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。MspA具有易改造和制備，穩(wěn)定性強(qiáng)能夠耐受酸堿環(huán)境、高溫和高電壓的優(yōu)點，此前已經(jīng)被成熟地應(yīng)用于DNA測序、單分子化學(xué)分析和納米孔力譜等方面。該篇工作也是MspA納米孔首次系統(tǒng)地應(yīng)用于蛋白質(zhì)-配體結(jié)合以及病理學(xué)突變相關(guān)的蛋白構(gòu)象變化的無標(biāo)記檢測，展現(xiàn)出了極佳的靈敏度和分辨率（圖1）。?
圖2. apo-wtCaM、Ca-wtCaM和M13-Ca-wtCaM捕獲的單分子特征
該工作選擇鈣調(diào)素（CaM）作為該策略的研究對象，對其三種構(gòu)象異構(gòu)體進(jìn)行了全面的實驗表征研究（圖2），證明了MspA納米陷阱能夠直接區(qū)分鈣調(diào)素的構(gòu)象變化。同時，作者也進(jìn)行了單個氨基酸病理突變型的結(jié)構(gòu)研究（圖3），首次從單分子尺度發(fā)現(xiàn)致病突變D129G引發(fā)鈣調(diào)素功能變化是由部分結(jié)構(gòu)域失去了結(jié)合鈣離子的能力，引起的結(jié)構(gòu)失調(diào)所導(dǎo)致的。
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圖3. 病理學(xué)突變型CaM-D129G捕獲的單分子特征
作者還評估了不同離子(Mg2+/Ca2+/Sr2+/Ba2+/Pb2+)對鈣調(diào)素功能的競爭關(guān)系，通過實時監(jiān)測離子結(jié)合產(chǎn)生的不同別構(gòu)狀態(tài)之間的比例進(jìn)行了系統(tǒng)的單分子研究，獲得了結(jié)合能力的排序。值得注意的是，鈣調(diào)素與金屬離子充分結(jié)合時具有相同的結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為平均阻孔電流相似，但仍然可用阻塞電流波動差異很好地區(qū)分開，證明不同離子結(jié)合鈣調(diào)素后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)波動不同，這是本研究中首次報道的一種現(xiàn)象。最后，作者使用MspA實時檢測了由Tb3+結(jié)合引起的鈣調(diào)蛋白的聚集過程并與Ca2+對比，首次捕獲到了鈣調(diào)素和Tb3+結(jié)合的一個中間態(tài)，揭示了Tb3+作為Ca2+的熒光替代物用于研究鈣結(jié)合蛋白的局限性。該工作證明了MspA作為傳感器對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的高度敏感性和巨大潛力，為納米孔蛋白質(zhì)分析提供了新選擇。
圖4. 鈣調(diào)素在不同二價離子存在下的結(jié)構(gòu)分析
該工作以“Allosteric Switching of Calmodulin in a Mycobacterium smegmatis?porin A (MspA) Nanopore-Trap“為題，于2021年8月27日發(fā)表于《德國應(yīng)用化學(xué)》（文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202110545，DOI: https://doi.org/10.1002/anie.202110545 ）。我院博士生劉瑤為該論文第一作者，我院黃碩教授為論文通訊作者，陳洪淵院士對該工作做出了重要指導(dǎo)。此項研究得到了生命分析化學(xué)國家重點實驗室以及南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院(ChemBIC)的重要支持。國家自然科學(xué)基金（項目編號：31972917, 91753108, 21675083）、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進(jìn)計劃（個人、團(tuán)體計劃）、江蘇省自然科學(xué)基金（項目編號：BK20200009）、南京大學(xué)生命科學(xué)分析化學(xué)國家重點實驗室(項目編號:5431ZZXM1902)、南京大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助項目等經(jīng)費(fèi)支持。
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