Cell Reports |李程/陶偉與合作者報(bào)道基于少量細(xì)胞的染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)及其在小鼠造血譜系中的應(yīng)用
2020年9月29日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李程研究組、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陶偉研究組與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所合作在《Cell Reports》雜志發(fā)表了題為“tagHi-C reveals 3D chromatin architecture dynamics during mouse hematopoiesis”的研究論文。
在此之前，對造血譜系各個(gè)階段細(xì)胞類型的染色質(zhì)三維構(gòu)象缺乏完整的研究。其中一個(gè)主要限制因素是已有的染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)大多需要大量的起始細(xì)胞，而體內(nèi)可分選的造血干細(xì)胞較少。因此，作者們首先開發(fā)了一種基于Tn5 tagmentation的少量細(xì)胞Hi-C技術(shù)（tagHi-C）。tagHi-C利用Tn5轉(zhuǎn)座酶對交聯(lián)、酶切、連接、純化后的線性DNA進(jìn)行打斷，代替了in situ Hi-C中使用的超聲打斷法（圖一）。由于Tn5轉(zhuǎn)座酶可對低至1ng的DNA高效隨機(jī)切割，因此作者們實(shí)現(xiàn)了對最低200個(gè)起始細(xì)胞的Hi-C文庫構(gòu)建。Tn5轉(zhuǎn)座酶在打斷DNA的同時(shí)會(huì)加上測序接頭，因此相比傳統(tǒng)的in situ Hi-C，tagHi-C在實(shí)驗(yàn)時(shí)間上也有較大的縮減。作者們將tagHi-C應(yīng)用到GM12878和HeLa細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能在多尺度下得到與傳統(tǒng)大量細(xì)胞Hi-C相似的結(jié)果，證明了方法的可靠性。
圖一：tagHi-C實(shí)驗(yàn)流程圖
緊接著，作者們將tagHi-C應(yīng)用到小鼠造血過程中的10個(gè)主要細(xì)胞類型，包括干/祖細(xì)胞以及以及成熟粒細(xì)胞（GR）和巨核細(xì)胞（MK）。作者們首先發(fā)現(xiàn)了造血譜系分化過程中染色質(zhì)區(qū)室（compartment）結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，并且區(qū)室結(jié)構(gòu)的變化與基因表達(dá)以及對應(yīng)細(xì)胞類型的功能有很強(qiáng)的相關(guān)性。
作者們接下來從更大的染色體結(jié)構(gòu)層面進(jìn)行研究，巨核/紅祖細(xì)胞（MEP），巨噬細(xì)胞（MK）和粒細(xì)胞（GR）相比其他細(xì)胞類型有著更加緊致的染色體結(jié)構(gòu)。10Mb左右線性距離的染色質(zhì)空間互作增加，而更加長距離的染色質(zhì)互作顯著減少。同時(shí)，MNase切割實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MEP、MK和GR細(xì)胞對MNase更不敏感，也證明其更加緊致的染色體結(jié)構(gòu)（圖二）。
圖二：在MEP，MK，GR中更加緊密的染色質(zhì)構(gòu)象
同時(shí)，tagHi-C的結(jié)果證明在MEP和GR細(xì)胞中，染色體的著絲粒端傾向于聚集成簇，端粒一端也傾向于聚集在一起，這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的RabI構(gòu)象相似。進(jìn)一步，作者也用FISH驗(yàn)證了RabI構(gòu)象隨著造血譜系分化逐漸明顯的趨勢（圖三）。作者猜測這種結(jié)構(gòu)的存在可能與染色質(zhì)的非遺傳學(xué)功能相關(guān)。比如，緊密的Rabl結(jié)構(gòu)可能利于MEP后期分化成紅細(xì)胞的脫核過程；有利于GR成熟過程中的細(xì)胞遷移過程。
圖三：血液譜系分化過程中逐漸建立的Rabl構(gòu)象
在基因?qū)用嫔?，作者們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的基因傾向于在基因內(nèi)部形成更加頻繁且均勻的互作，作者們將這一結(jié)構(gòu)定義為GAD（Gene-body Associating Domain）。與之前文獻(xiàn)定義的染色體環(huán)（loop）結(jié)構(gòu)不同，GAD兩端沒有顯著富集的CTCF結(jié)合位點(diǎn)。擁有GAD結(jié)構(gòu)的基因內(nèi)部會(huì)富集更強(qiáng)烈的H3K4me1和RNA Pol II的信號，證明了GAD結(jié)構(gòu)與活躍轉(zhuǎn)錄的高度相關(guān)性。通過比較不同細(xì)胞的GAD強(qiáng)弱差異，作者們發(fā)現(xiàn)，有GAD結(jié)構(gòu)的基因通常與細(xì)胞類型特異的功能高度相關(guān)。比如Meis1在HSC（造血干細(xì)胞）中形成明顯的GAD結(jié)構(gòu)，在GR中則不存在，而Meis1已經(jīng)被多次報(bào)道與干細(xì)胞的功能高度相關(guān)（圖四）。
圖四：血液分化中動(dòng)態(tài)變化的GAD結(jié)構(gòu)
最后，作者們將tagHi-C和GWAS數(shù)據(jù)做了聯(lián)合分析。于GWAS分析中將血液疾病或性狀SNP關(guān)聯(lián)到線性距離最近的基因不同，tagHi-C鑒定出來的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)可能介導(dǎo)某些GWAS SNP參與調(diào)控遠(yuǎn)端的靶基因。以SNP rs77527100為例，它與“髓系細(xì)胞中的粒細(xì)胞的比例”相關(guān)。通過線性最近距離，rs77527100被注釋到CCDC26這個(gè)lncRNA的內(nèi)含子區(qū)域，而利用tagHi-C鑒定出的染色質(zhì)環(huán)，作者發(fā)現(xiàn)在造血干/祖細(xì)胞中，此SNP位點(diǎn)與Myc基因有較強(qiáng)的互作，并且這個(gè)SNP位點(diǎn)附近有明顯的H3K4me1和H3K27ac信號，提示在干/祖細(xì)胞中，rs77527100位點(diǎn)所在區(qū)域作為增強(qiáng)子潛在調(diào)控Myc基因的表達(dá)（圖五）。同時(shí)作者也發(fā)現(xiàn)了其他類似的空間調(diào)控關(guān)系，比如Hoxa cluster和Pten，支持了三維基因組結(jié)構(gòu)用于解釋GWAS SNPs功能的重要作用。
圖五：通過染色質(zhì)環(huán)關(guān)聯(lián)GWAS位點(diǎn)和潛在性狀基因
總的來說，該研究開發(fā)了一種簡便高效的少量細(xì)胞Hi-C技術(shù)（tagHi-C），利用該技術(shù)產(chǎn)生了小鼠造血譜系分化過程中的十種細(xì)胞類型的三維基因組數(shù)據(jù)圖譜，并且從染色質(zhì)緊致程度、RabI構(gòu)象、GAD結(jié)構(gòu)以及染色質(zhì)環(huán)與GWAS的數(shù)據(jù)整合等方面進(jìn)行了研究。該研究為理解小鼠造血譜系染色質(zhì)構(gòu)象提供了豐富的數(shù)據(jù)資源，也為其他需要應(yīng)用少量細(xì)胞Hi-C的研究問題提供了參考實(shí)驗(yàn)方法和分析思路。
北京大學(xué)PTN項(xiàng)目博士生張超、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生徐子晗、血研所助理研究員楊尚達(dá)博士以及博士生孫國歡為并列第一作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李程研究員、陶偉教授和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所程輝副研究員、程濤教授為共同通訊作者。北京大學(xué)博士后賈璐萌參與了tagHi-C實(shí)驗(yàn)技術(shù)開發(fā)，血研所博士生鄭昭烽和顧荃參與了研究工作。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院季雄研究員提供了寶貴建議。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的資助。并得到了北京大學(xué)“北極星”高性能計(jì)算平臺的支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.108206
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