雷曉光課題組與合作者研究發(fā)現(xiàn)植物利用獨特的天然產(chǎn)物實現(xiàn)“不戰(zhàn)而屈人之兵”的抗菌策略
2020年4月8日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院雷曉光課題組與合作者中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所周儉民課題組、國家蛋白質(zhì)中心楊靖課題組共同在Cell子刊《Cell Host＆Microbe》雜志上發(fā)表了題為“An Arabidopsis secondary metabolite directly targets expression of the bacterial type III secretion system to inhibit bacterial virulence”的文章，闡明了植物通過產(chǎn)生異硫氰酸酯類小分子天然產(chǎn)物Sulforaphane（SFN）特異性抑制植物病原菌III型分泌系統(tǒng)，從而達(dá)到“不戰(zhàn)而屈人之兵”的有效抗菌策略。該研究發(fā)現(xiàn)了植物內(nèi)源天然產(chǎn)物在植物與微生物相互作用中所扮演的重要角色，揭示了新穎的生物作用機(jī)制，為植物保護(hù)提供了新的研究思路。
植物產(chǎn)生的硫代葡萄糖苷類天然產(chǎn)物因為其獨特的生物活性受到廣泛關(guān)注。硫苷是植物體內(nèi)合成的含氮、硫的次生代謝化合物，在十字花科植物中含量較高。硫苷通過芥子酶的作用可形成包括異硫氰酸酯（Isothiocyanate）在內(nèi)的一系列下游天然產(chǎn)物，在植物抵御病原菌侵染以及昆蟲的取食中發(fā)揮著重要的作用。除了在植物防衛(wèi)中起到重要作用，異硫氰酸酯類化合物也被證實具有很好的抗腫瘤活性。前期大量的流行病學(xué)研究顯示：食用富含異硫氰酸酯類化合物的十字花科植物如卷心菜、西蘭花等，能有效地降低胃腸道癌癥風(fēng)險。因此，這類化合物一直被認(rèn)為是西蘭花等蔬菜產(chǎn)生癌癥預(yù)防功效的主要活性成分（圖一）。但是，這類植物內(nèi)源性天然產(chǎn)物對于植物自身生理、病理過程的具體作用機(jī)制尚不清楚。
圖一：異硫氰酸酯（Isothiocyanate）的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其被報道過的生物活性
（圖片摘自：https://www.healthwriting.com/wp-content/uploads/sulforophane-featured.jpg）
許多植物天然產(chǎn)物通過抑制細(xì)菌的生命活動殺死細(xì)菌，這一過程對有害和有益微生物都具有殺傷作用，因此容易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。前期研究表明，植物有可能通過一些未知的機(jī)制，特異性抑制植物病原菌III型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，使得植物病原菌無法通過III型分泌系統(tǒng)分泌致病效應(yīng)蛋白，從而起到降低病原菌的致病性。因此，探究植物如何通過讓病原菌的致病“武器”III型分泌系統(tǒng)失效，將病原菌與共生菌區(qū)別開來，達(dá)到“不戰(zhàn)而屈人之兵”的抗菌效果，已經(jīng)成為植物生物學(xué)研究領(lǐng)域一個很重要的科學(xué)問題。
雷曉光課題組一直致力于天然產(chǎn)物合成與化學(xué)生物學(xué)研究，主要聚焦在揭示植物來源天然產(chǎn)物獨特的生物活性機(jī)制，開發(fā)有效的化學(xué)合成與生物合成策略，高效制備結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然產(chǎn)物分子，以及開展天然產(chǎn)物創(chuàng)新藥物研究。在本課題中，雷曉光課題組與周儉民課題組合作，利用生物活性導(dǎo)向的天然產(chǎn)物分離策略，首先觀察到擬南芥的醇提物具有抑制丁香假單胞菌III型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因（效應(yīng)蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）的轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)的作用，通過多次化學(xué)分離、純化過程得到了具有最強(qiáng)抑制活性的天然產(chǎn)物分子。通過核磁共振、質(zhì)譜等化學(xué)結(jié)構(gòu)表征手段，鑒定出該天然產(chǎn)物分子為Sulforaphane（SFN）。進(jìn)一步生物驗證表明：在SFN作用下，III型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白α-AvrPto的表達(dá)水平顯著下降，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平也隨著SFN濃度升高而降低。在擬南芥植株上對SFN生物合成途徑進(jìn)行敲除后，擬南芥胞間液中不再檢出SFN，與之相對應(yīng)的是敲除生物合成途徑的突變株比野生型更易感病，從植株水平確證了SFN作為擬南芥防御分子的作用（圖二）。
圖二：通過生物活性導(dǎo)向的天然產(chǎn)物分離鑒定出Sulforaphane（SFN）可以抑制病原菌三型分泌系統(tǒng)
（圖片摘自：Wang et al., 2020, Cell Host & Microbe 27, 601–613）
為了闡明SFN的明確生物作用機(jī)制，他們進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組分析以及化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出了SFN分子的相互作用靶點蛋白和具體作用位點（圖三）。SFN具有親電性的異硫氰基，能夠通過加成反應(yīng)共價地結(jié)合半胱氨酸（Cys）上的硫醇。因此他們采取了化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中的定量硫醇反應(yīng)活性分析技術(shù)(Quantitative Thiol Reactivity Profiling, QTRP)，全局性以及位點特異性地尋找SFN結(jié)合的半胱氨酸殘基。首先他們將Pst DC3000用SFN處理2h（對照組不加SFN）后,分別提取全蛋白。接著利用具有硫醇反應(yīng)性的生物正交反應(yīng)探針，對半胱氨酸殘基進(jìn)行一個全局性的標(biāo)記，之后酶切成肽段。用輕重同位素標(biāo)記的可光解的疊氮生物素與SFN處理組和未處理組的肽段進(jìn)行生物正交反應(yīng)，并用鏈霉親和素富集。最后光解后獲得輕重同位素標(biāo)記的肽段，通過LC-MS分析。在SFN處理組中標(biāo)記的特定的含半胱氨酸肽段數(shù)量減少，則說明SFN對特定的半胱氨酸殘基的結(jié)合。通過這樣的策略，他們鑒定出了在III型分泌系統(tǒng)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子HrpS的209位存在著SFN的修飾（圖三）。進(jìn)一步實驗證明，SFN共價結(jié)合了HrpS的209位半胱氨酸，阻止了HrpS和HrpR的結(jié)合。而HrpS和HrpR只有結(jié)合形成異源六聚體，才能激活hrpL基因的表達(dá)。HrpL作為選擇性σ因子，誘導(dǎo)丁香假單胞菌III型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)該類天然產(chǎn)物只對植物治病菌有抑制作用，而對于很多植物共生菌沒有明顯抑制作用。
圖三：利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)SFN靶點蛋白
（圖片摘自：Wang et al., 2020, Cell Host & Microbe 27, 601–613）
綜上所述，該合作團(tuán)隊首先通過活性導(dǎo)向天然產(chǎn)物分離鑒定出了擬南芥中異硫氰酸酯類化合物SFN,確證了其抑制植物病原菌III型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的活性。進(jìn)一步通過化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出SFN的靶點蛋白和作用位點，表明了SFN直接結(jié)合HrpS蛋白209位的半胱氨酸殘基，抑制HrpS和HrpR六聚體的形成，從而抑制了HrpL的表達(dá)，使得植物病原菌III性分泌系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)受到抑制。通過該生物機(jī)制，SFN分子能夠特異性的降低病原菌的致病性，而不對益生菌產(chǎn)生毒性，起到了靶向防御的作用（圖四）。孫子曰：“凡用兵之法，全國為上，破國次之”，通過將病原菌與益生菌區(qū)別開來并“解除武裝”，植物能夠最大限度的保證自身的正常生理活動不受影響，達(dá)到“不戰(zhàn)而屈人之兵”的抗菌效果。
圖四：SFN的生物作用機(jī)制總結(jié)
（圖片摘自：Wang et al., 2020, Cell Host & Microbe 27, 601–613）
在該工作中王偉博士和楊靖研究員為論文的共同第一作者，雷曉光教授和周儉民研究員為共同通訊作者。褚金芳研究團(tuán)隊和白洋研究團(tuán)隊也參與了該項工作。該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、中國科學(xué)院國際合作重點項目、北京市“卓越青年科學(xué)家計劃”、北京分子科學(xué)國家研究中心、植物基因組學(xué)國家重點實驗室以及北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。
論文鏈接：https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(20)30168-2
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