Nature|陳雷組報(bào)道降糖藥恩格列凈抑制人源SGLT2-MAP17轉(zhuǎn)運(yùn)子的結(jié)構(gòu)機(jī)制
葡萄糖是地球上絕大多數(shù)生物最重要的能量來源之一。葡萄糖經(jīng)血液循環(huán)被運(yùn)輸至身體各個(gè)器官。在血液流經(jīng)腎臟時(shí)，絕大部分葡萄糖會(huì)被濾出，然后再被重吸收回血液。腎臟每天重吸收的葡萄糖達(dá)到180g，才保證了最終排出的尿液中不含葡萄糖1。因此，腎臟是維持血漿中葡萄糖水平的重要器官。
腎臟中負(fù)責(zé)葡萄糖重吸收的主要蛋白為鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SGLT），其屬于溶質(zhì)載體轉(zhuǎn)運(yùn)子超家族5A（solute carrier transporter 5A）中的一員，與GLUT（SLC2A）截然不同2。SGLT蛋白利用鈉離子的電化學(xué)勢(shì)驅(qū)動(dòng)葡萄糖逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，在轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的同時(shí)，伴隨著鈉離子的生電轉(zhuǎn)運(yùn)2。在人類中，SGLT 共發(fā)現(xiàn)有六種亞型，其中在腎臟中主要起作用的為SGLT1和SGLT2。SGLT2 位于腎臟近曲小管的S1和S2節(jié)段，負(fù)責(zé)原尿中90%葡萄糖的重吸收3，并且其活性依賴于附屬亞基MAP17 4。SGLT1 位于近曲小管 S3 節(jié)段，負(fù)責(zé)殘余葡萄糖的重吸收。SGLT2的失活突變會(huì)引起家族性腎性尿糖，這類患者除了尿糖高以外沒有其他明顯的臨床癥狀3,4。此外，早在1886年，德國(guó)藥學(xué)家約瑟夫馮梅林發(fā)現(xiàn)從蘋果樹根皮中萃取的天然產(chǎn)物根皮苷（Phlorizin）可以使動(dòng)物多尿、排出尿糖、減輕體重。隨后的研究發(fā)現(xiàn)：根皮苷就是SGLT的天然抑制劑。上世紀(jì)80年代末，90年代初，編碼負(fù)責(zé)葡萄糖重吸收的SGLT1和SGLT2蛋白的基因也先后被克隆出來5,6。這一系列在基礎(chǔ)研究方面的進(jìn)展促使制藥界開始關(guān)注SGLT2抑制劑的開發(fā)。其理念是希望通過抑制SGLT蛋白的功能，使原尿中的葡萄糖無法被重吸收，從而通過尿液排出體外，達(dá)到間接降血糖的目的。與SGLT2相比，SGLT1 在腎臟中僅負(fù)責(zé)重吸收小部分葡萄糖，并且還在腸道中負(fù)責(zé)葡萄糖的攝取7，抑制其功能后的降糖效果和副作用有待進(jìn)一步研究。所以SGLT2成為治療糖尿病的重要小分子藥物靶點(diǎn)之一。
基于天然產(chǎn)物根皮苷的結(jié)構(gòu)，目前，已有多種SGLT2的特異性抑制劑被成功開發(fā)出來，并應(yīng)用于臨床用于治療2型糖尿病，比如恩格列凈（Empagliflozin）、卡格列凈（Canagliflozin）、達(dá)格列凈（Dapagliflozin）等8，其中恩格列凈對(duì)SGLT2的選擇性是SGLT1的2500倍9。這些藥物降糖療效顯著，驗(yàn)證了“通過尿出糖來降血糖”這一治療思路的正確性。除了降血糖的功能外，這三種SGLT2的抑制劑還有治療心衰、腎臟保護(hù)等多種臨床效果10，被譽(yù)為“神藥”。盡管SGLT2抑制劑在2型糖尿病的治療中具有重要價(jià)值，目前仍不清楚這些藥物是如何抑制SGLT2蛋白功能的。
2021年12月8日，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心（CLS）、北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所陳雷課題組在《Nature》雜志發(fā)表題目為 “Structural basis of inhibition of the human SGLT2-MAP17 glucose transporter” 的文章，報(bào)導(dǎo)了人源SGLT2-MAP17復(fù)合物與抑制劑恩格列凈結(jié)合的2.95?冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。鏈接見：https://www.nature.com/articles/s41586-021-04212-9。
SGLT2分子量?jī)H為~73 kDa，附屬亞基MAP17為單次跨膜的膜蛋白。二者均沒有明顯的可溶區(qū)結(jié)構(gòu)域。利用冷凍電鏡技術(shù)解析SGLT2-MAP17異源二聚體的結(jié)構(gòu)具有挑戰(zhàn)。作者們經(jīng)過多年積累和摸索，創(chuàng)新性地采用“三接頭固定”的策略將GFP融合在SGLT2胞內(nèi)的loop區(qū)，將GFP納米抗體融合在MAP17胞內(nèi)端11，利用GFP和nanobody的高親和力成功地把GFP-nanobody復(fù)合物嵌合在SGLT2-MAP17胞內(nèi)側(cè)，從而為冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)提供了指示性標(biāo)記。作者在克服了蛋白純化，納米盤組裝、冷凍樣品制備和數(shù)據(jù)處理等一系列困難之后，最終獲得了SGLT2-MAP17復(fù)合物和抑制劑結(jié)合的分辨率為2.95 ?的電子密度，并搭建了原子模型。
圖1. SGLT2-MAP17蛋白的電子密度圖和拓?fù)涫疽鈭D。
SGLT2為14次跨膜蛋白，其中TM1-10為轉(zhuǎn)運(yùn)的核心結(jié)構(gòu)，TM1-5和TM6-10在拓?fù)渖蠟榉聪蛑貜?fù)的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)運(yùn)的核心結(jié)構(gòu)和原核生物亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（LeuT）類似。TM0，TM11-13在核心結(jié)構(gòu)的周圍，附屬亞基MAP17通過疏水相互作用與TM13結(jié)合（圖1）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，真核生物SGLT家族蛋白在胞外葡萄糖入口的上面，有一個(gè)蓋子樣的結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)由四對(duì)二硫鍵來穩(wěn)定（圖2）。在胞內(nèi)側(cè)，長(zhǎng)的IL6與IL1和IL5發(fā)生相互作用（圖2），這些相互作用可能對(duì)SGLT2的功能非常重要。
圖2. SGLT2和MAP17的相互作用及真核生物SGLT2特異的特征
抑制劑恩格列凈結(jié)合在SGLT2蛋白的中間，抑制劑的葡萄糖基占據(jù)了葡萄糖的結(jié)合位點(diǎn)，葡萄糖基的羥基與SGLT2的氨基酸發(fā)生了極性相互作用。抑制劑的糖苷配基從葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)往外延伸，直到蛋白外側(cè)，將SGLT2鎖定在向外開放狀態(tài)（outward-open）（圖3）。抑制劑的氯苯基和SGLT2的H80相互作用，中間的苯基與SGLT2的F98、V95、L84和F453通過疏水相互作用，末端的四氫呋喃基團(tuán)和SGLT2的F98、L274氨基酸相互作用（圖3）。作者將SGLT2的F98和F453分別突變?yōu)楸彼岚l(fā)現(xiàn)，突變的SGLT2降低了和抑制劑的結(jié)合，減弱了抑制劑的抑制作用。此外，作者還將和抑制劑結(jié)合的SGLT2氨基酸突變?yōu)镾GLT1對(duì)應(yīng)的氨基酸，發(fā)現(xiàn)抑制劑的抑制效果也減弱。這在一定程度上解釋了恩格列凈對(duì)SGLT2相較于SGLT1的高選擇性。
圖3. 抑制劑恩格列凈的結(jié)合位點(diǎn)
作者捕捉到的與抑制劑結(jié)合的SGLT2的向外開放狀態(tài)和原核生物vSGLT的向內(nèi)開放狀態(tài)有很大的差別。在向外開放狀態(tài)的SGLT2中，葡萄糖的出口是關(guān)閉的。通過與vSGLT結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn)，TM1、TM2、TM6和TM7的移動(dòng)是SGLT2葡萄糖出口打開的關(guān)鍵。
圖4. SGLT2抑制劑的工作機(jī)制模式圖
綜上所述，作者通過冷凍電鏡對(duì)SGLT2-MAP17復(fù)合物和抑制劑的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)抑制劑將SGLT2鎖定在向外開放狀態(tài)，確定了SGLT2抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)，闡釋了抑制劑抑制SGLT2的工作機(jī)制（圖4），為SGLT家族抑制劑的進(jìn)一步優(yōu)化提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)所博士研究生牛延革為本論文的第一作者，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心（CLS）陳雷研究員為論文的通訊作者。該研究還得到陳雷課題組的博士生劉銳和博士后管成成，CLS、北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院陳知行研究員及其博士生張?jiān)蠢镁康臒晒鈽?biāo)記技術(shù)，為本課題提供了高純度熒光標(biāo)記的葡萄糖底物。勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司（Boehringer-Ingelheim Pharma, GmbH & Co KG）的Stefan Hoerer和Herbert Nar為本課題提供了恩格列凈及其同位素標(biāo)記物。在該課題開展過程中，勃林格殷格翰中國(guó)分公司的張巍怡和葉俊青給予了大力協(xié)助。該工作冷凍電鏡樣品制備、篩選和采集在北京大學(xué)電鏡平臺(tái)和冷凍電鏡平臺(tái)完成，得到了李雪梅、郭振璽、邵博、裴霞和王國(guó)鵬等人的幫助。臺(tái)灣大學(xué)的許麗卿(Lih-Ching Hsu)教授饋贈(zèng)了1-NBDG樣品用于課題的前期摸索。同位素實(shí)驗(yàn)由北京大學(xué)生科院的黃士堂協(xié)助完成。該項(xiàng)目的數(shù)據(jù)處理獲得了北京大學(xué)CLS北極星計(jì)算平臺(tái)及未名超算平臺(tái)的硬件和技術(shù)支持。博士后管成成受到了勃林格殷格翰公司博士后項(xiàng)目的支持；該課題得到國(guó)家自然科學(xué)基金、CLS等經(jīng)費(fèi)支持。陳雷實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于代謝類疾病和心血管疾病藥物靶點(diǎn)的工作機(jī)制，先后解析了胰島細(xì)胞葡萄糖感受器KATP，一氧化氮受體sGC等結(jié)構(gòu)，希望對(duì)此方向感興趣的研究生及博士后加入。
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