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化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是注釋蛋白質(zhì)功能和發(fā)現(xiàn)生物活性配體靶標(biāo)的重要工具。在化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中，最常用的是基于活性的蛋白質(zhì)分析（Activity-based protein profiling，簡稱ABPP），該方法通過結(jié)合活性分子探針標(biāo)記和串聯(lián)質(zhì)譜分析，實(shí)現(xiàn)靶蛋白的鑒定。隨著定量組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們將活性分子探針和基于同位素標(biāo)簽的蛋白質(zhì)組學(xué)方法相結(jié)合，開發(fā)了一系列定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，包括基于一級譜定量的isoTOP（基于同位素的串聯(lián)正交蛋白水解）-ABPP技術(shù)和rdTOP（基于還原二甲基化的串聯(lián)正交蛋白水解）-ABPP技術(shù)以及基于二級譜定量的MTRP（多通道活性巰基篩選）技術(shù)和SLC（流線型的半胱氨酸）-ABPP技術(shù)。然而，這些技術(shù)依賴于半隨機(jī)性的數(shù)據(jù)依賴型質(zhì)譜采集模式（Data-dependent acquisition，簡稱DDA），以及成本高昂的同位素定量標(biāo)簽試劑，限制了化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在多維分析和高通量篩選中的應(yīng)用。

伴隨著高靈敏度、高分辨率、高精度的質(zhì)譜儀器的快速更新，以及生物信息學(xué)對于海量數(shù)據(jù)處理能力的不斷提高，近些年來興起的基于數(shù)據(jù)非依賴型采集的質(zhì)譜采集模式Data-independent acquisition，簡稱DIA）逐漸在蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域中嶄露頭角。與傳統(tǒng)的DDA模式不同，DIA模式并不僅限于對高強(qiáng)度的肽段離子進(jìn)行采集和分析，而是將離子根據(jù)質(zhì)荷比大小劃分成若干個(gè)采集窗口后，對每個(gè)窗口中所有肽段進(jìn)行合并分析，從而可以實(shí)現(xiàn)無遺漏、無差異的肽段信息采集，因此，DIA模式具有更好的覆蓋度，重現(xiàn)性以及定量準(zhǔn)確性。

近日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心王初課題組在Journal of the American Chemical Society雜志上發(fā)表了題為“Quantitative Chemoproteomic Profiling with Data-Independent Acquisition-based Mass Spectrometry”的研究論文。在這項(xiàng)工作中，作者將DIA模式與ABPP技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了名為DIA-ABPP的無標(biāo)定量方法。該方法解決了之前定量技術(shù)中由DDA模式引起的數(shù)據(jù)丟失嚴(yán)重以及高成本的同位素標(biāo)簽試劑的使用等問題，是一種覆蓋度高、重現(xiàn)性好以及定量準(zhǔn)確的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)新策略。

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在完成方法的建立和優(yōu)化后，作者首先利用DIA-ABPP對活性代謝物——4-羥基壬烯醛（HNE）修飾半胱氨酸的反應(yīng)性進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。得到了每個(gè)活性半胱氨酸對應(yīng)的HNE劑量效應(yīng)曲線以及半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）。除了已知的HNE修飾位點(diǎn)外，本工作還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移蛋白（CPTP）的C105也是對于HNE高敏感的半胱氨酸位點(diǎn)，這些數(shù)據(jù)可以為后續(xù)內(nèi)源親電修飾在細(xì)胞內(nèi)的生物機(jī)制研究提供更加完整的數(shù)據(jù)支持。

此外，作者也將新方法用于共價(jià)片段小分子庫的篩選。作者構(gòu)建了24個(gè)共價(jià)片段分子庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了563個(gè)可靶向的蛋白質(zhì)。對于單一蛋白而言，新方法可以鑒定到更多的半胱氨酸位點(diǎn)，例如核孔蛋白NUP205，DIA-ABPP方法可以定量16個(gè)半胱氨酸，而原來的方法只能獲得2個(gè)半胱氨酸的定量信息。此外，作者也對具有相同結(jié)合基團(tuán)，不同反應(yīng)基團(tuán)的片段分子對進(jìn)行了頭對頭的比較，強(qiáng)調(diào)了反應(yīng)基團(tuán)對半胱氨酸靶向性的影響。

最后，作者將DIA-ABPP技術(shù)應(yīng)用于生物鐘機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)在所有定量的半胱氨酸中，18.43%的半胱氨酸活性具有晝夜節(jié)律特征，其比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蛋白質(zhì)，且兩者相位的峰值具有明顯的差異。除了氧化還原通路外，作者還發(fā)現(xiàn)這些活性具有晝夜節(jié)律特征的半胱氨酸富集在代謝通路以及泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中，這些數(shù)據(jù)為生物鐘機(jī)制的研究提供了新視角和新線索。

總之，該工作發(fā)展了一種無標(biāo)的定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)策略DIA-ABPP，具有重現(xiàn)性好，覆蓋度高，定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢。由于ABPP是個(gè)基于分子探針設(shè)計(jì)和生物系統(tǒng)應(yīng)用的模塊化平臺，具有很高的兼容性，該方法可以用于高通量臨床樣品的分析，挖掘蛋白質(zhì)功能和翻譯后修飾相關(guān)的生物標(biāo)志物，為疾病機(jī)理的研究和診斷方法的開發(fā)提供技術(shù)支持。

該論文的通訊作者為北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的王初教授，化學(xué)與分子工程學(xué)院2015級博士生楊帆為第一作者。王初課題組的研究生賈國賡，劉源博士以及前沿交叉學(xué)院研究生郭九州等合作者為該工作做出了貢獻(xiàn)。該工作得到了科技部、基金委、北京分子科學(xué)國家研究中心、教育部生物有機(jī)和分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)費(fèi)支持。

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文章鏈接：

https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.1c11053

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