宋保亮/仇文衛(wèi)/趙曉璐揭示SMO蛋白膽固醇化修飾的生化反應機制
近日，武漢大學宋保亮、趙曉璐和華東師范大學仇文衛(wèi)課題組合作在Cell Research發(fā)表了題為《Cholesterylation of Smoothened is a calcium-accelerated autoreaction involving an intramolecular ester intermediate/鈣離子促進Smoothened蛋白通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)酯反應形成膽固醇共價修飾》的研究論文，闡明了SMO蛋白的膽固醇修飾是一個由鈣離子加速的自發(fā)反應，揭示了鈣離子在Hedgehog信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要作用，并證明膽固醇修飾對于SMO功能發(fā)揮至關重要【1】。
Hedgehog（Hh）信號通路是一種從果蠅到哺乳動物高度保守的信號通路。Hh通路的信號轉(zhuǎn)導主要由三個蛋白完成——分泌蛋白Hh、Hh受體Patched 1（PTCH1）以及G蛋白偶聯(lián)受體Smoothened（SMO）。Hh信號通路在胚胎發(fā)育和成體器官穩(wěn)態(tài)維持過程中起重要作用，而異常激活的Hh信號通路會引起多種腫瘤。當細胞外Hh濃度升高時，Hh結合PTCH1，解除PTCH1對于SMO的抑制作用，使得定位于細胞內(nèi)囊泡的SMO轉(zhuǎn)移到初級纖毛，SMO進一步將胞外信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)激活GLI等轉(zhuǎn)錄因子【2】。
2017年宋保亮與仇文衛(wèi)合作首次報道了SMO蛋白被膽固醇共價修飾。人SMO蛋白通過其胞外cysteine-rich domain（CRD）中第95位天冬氨酸側鏈羧基與膽固醇3β羥基形成酯鍵【3】。但SMO蛋白膽固醇共價修飾的化學反應機理和調(diào)控機制尚不清楚。
在本工作中，研究人員首先在體外重構了SMO蛋白的膽固醇化共價修飾反應，發(fā)現(xiàn)該反應不依賴于額外的能量和其它蛋白，但鈣離子能增強膽固醇探針對SMO的共價修飾。進一步質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)修飾位點D95會首先與臨近的Y130側鏈形成內(nèi)酯，鈣離子通過促進D95-Y130內(nèi)酯向D95-膽固醇酯的轉(zhuǎn)酯反應，增強SMO的膽固醇修飾（圖1）。
圖1. SMO膽固醇化共價修飾的化學反應機理
隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)當細胞受到Hh信號刺激時，SMO早期內(nèi)體囊泡中的鈣離子濃度明顯上升。進一步篩選發(fā)現(xiàn)Hh信號通過激活STIM-ORAI1鈣離子通道介導胞外鈣離子內(nèi)流（圖2）。
圖2. Hh促進SMO膽固醇化修飾的信號轉(zhuǎn)導途徑
為探究膽固醇共價修飾對于激活SMO的重要性，研究人員基于SMO結構構建了SMO(D95E)突變。該突變保留SMO結合膽固醇的能力，但不能被膽固醇共價修飾。在細胞水平上，SMO(D95E)突變體極大降低下游Hh信號通路活性。同源位點(SmoD99E)敲入純合子小鼠表現(xiàn)出嚴重發(fā)育遲緩，導致胚胎致死，說明膽固醇修飾缺失會完全抑制SMO蛋白的活性。
武漢大學高等研究院的胡傲博士和華東師范大學化學與分子工程學院博士研究生張竟贊為本論文共同第一作者。宋保亮教授、趙曉璐副教授和仇文衛(wèi)教授為通訊作者。該研究工作得到了基金委“生物大分子動態(tài)修飾與化學干預”重大研究計劃資助。
參考文獻
1. Hu A, Zhang JZ, Wang J, Li CC, Yuan M, Deng G, Lin ZC, Qiu ZP, Liu HY, Wang XW, Wei PC, He X, Zhao X, Qiu WW, Song BL. Cholesterylation of Smoothened is a calcium-accelerated autoreaction involving an intramolecular ester intermediate. Cell Research. 0:1–14; https://doi.org/10.1038/s41422-022-00622-0 (2022).
2. Hu A, Song BL. The interplay of Patched, Smoothened and cholesterol in Hedgehog signaling. Curr Opin Cell Biol. 61:31-38 (2019).
3. Xiao X, Tang JJ, Peng C, Wang Y, Fu L, Qiu ZP, Xiong Y, Yang LF, Cui HW, He XL, Yin L, Qi W, Wong CC, Zhao Y, Li BL, Qiu WW, Song BL. Cholesterol Modification of Smoothened Is Required for Hedgehog Signaling. Mol Cell. 66(1):154-162 (2017).
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