最新研究成果 | 清華大學(xué)藥學(xué)院唐葉峰課題組及其合作者發(fā)現(xiàn)新作用機(jī)理的抗結(jié)核分枝桿菌化合物
時間：2022-02-11 20:03:02學(xué)院：藥學(xué)院學(xué)校：清華大學(xué)
近日，清華大學(xué)藥學(xué)院唐葉峰課題組與北京全球健康藥物研發(fā)中心陳爍團(tuán)隊(duì)、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤課題組共同合作，在《ACS Chem Biol》上發(fā)表了題為“天然產(chǎn)物吲哚霉素及其合成衍生物的抗結(jié)核分枝桿菌作用研究”的重要研究成果。該研究首次詳細(xì)揭示了吲哚霉素對結(jié)核分枝桿菌的抑菌活性和分子水平的作用機(jī)理，以及分枝桿菌可能產(chǎn)生的抗藥頻率和其機(jī)理，為發(fā)展新型抗結(jié)核藥物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
?
研究背景
?
在新型冠狀病毒肺炎全球大流行的背景下，人類結(jié)核病的感染和病亡率也在不斷升高，社會對抗結(jié)核藥物的研發(fā)有著更為緊迫的要求。吲哚霉素（indolmycin，IND）是灰色鏈霉菌產(chǎn)生的天然抗生素，它能選擇性地抑制病原細(xì)菌的色氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶TrpRS，但未見對動物細(xì)胞的毒副作用。TrpRS是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的必需關(guān)鍵酶，它與近年來引起關(guān)注的一系列色氨酸生物合成酶都是開發(fā)新型抗結(jié)核藥物的重要靶點(diǎn)。基于作者對鏈霉菌天然產(chǎn)物和色氨酰tRNA合成酶抑制劑的研究經(jīng)驗(yàn)，本研究首次詳細(xì)揭示了吲哚霉素對分枝桿菌的抑菌活性和分子水平的作用機(jī)理，以及分枝桿菌可能產(chǎn)生的抗藥頻率和及其機(jī)理等。該研究通過建立生化實(shí)驗(yàn)分析了多種全化學(xué)合成的吲哚霉素類似物，發(fā)現(xiàn)多個類似物的最低抑菌濃度（MIC）較起始天然產(chǎn)物降低了7～14倍。其中，4’-甲基化吲哚霉素（Y-13）的MIC較穩(wěn)定，且達(dá)到0.5μg/ml，并能與色氨酸生物合成途徑中TrpE的變構(gòu)抑制劑吲哚丙酸（IPA）產(chǎn)生協(xié)同作用，能更有效地殺死體外分枝桿菌，提示針對病原體色氨酸合成和蛋白合成途徑設(shè)計(jì)雙重抑制，能開發(fā)一類新型抗生素有效應(yīng)對耐藥結(jié)核分枝桿菌。
研究方法
通過異源表達(dá)純化獲得Mtb TrpRS蛋白，建立新型的不依賴于tRNA的生化實(shí)驗(yàn)以分析Mtb TrpRS的酶活性。同時，系統(tǒng)地分析了吲哚霉素對多種分枝桿菌（如Mtb、BCG和Msmeg等）的體外抑菌濃度，對哺乳動物細(xì)胞的毒性，以及對Mtb TrpRS的多種生化參數(shù)（IC50，Ki和KD）。吲哚霉素及光學(xué)純類似物經(jīng)改良的5步化學(xué)全合成路線制備。TrpRS蛋白與化合物在2.5?分辨率的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)中也被詳盡解析，作為建立結(jié)構(gòu)和活性相關(guān)性的基礎(chǔ)。在相關(guān)細(xì)菌學(xué)研究中，建立過量表達(dá)trpS基因的BCG菌株可以對化合物進(jìn)行靶向分析，還可以對其聯(lián)合用藥的協(xié)調(diào)作用進(jìn)行分析，也可以進(jìn)行時間依賴的動態(tài)殺菌檢測實(shí)驗(yàn)，對體外篩選的BCG菌株和Msmeg抗吲哚霉素類似物突變株及其基因組進(jìn)行測序。
?
研究結(jié)果
一、對天然產(chǎn)物吲哚霉素的初步評價
?
天然產(chǎn)物吲哚霉素對慢生長非結(jié)核分枝桿菌的MIC約為4μg/ml；只抑制少數(shù)病原菌生長，對革蘭氏陰性菌和大部分腸道細(xì)菌沒有作用；在10倍MIC濃度下對動物細(xì)胞沒有毒性。它的生化和物理化學(xué)指標(biāo)均達(dá)到了做藥物先導(dǎo)化合物的要求。
?Figure 1.??Structure of IND and initial assessments
?
二、建立Mtb TrpRS酶活性測定實(shí)驗(yàn)及分析蛋白和配體的共晶結(jié)構(gòu)
?
TrpRS酶活反應(yīng)分為兩步：第一步，消耗ATP激活氨基酸，ATP和氨基酸在酶的催化下生成Trp-AMP和焦磷酸（PPi），中間體Trp-AMP與酶有高親和力的結(jié)合；第二步，以tRNA為受體，接收中間體中酰化的氨基酸的轉(zhuǎn)移，生成Trp-tRNA并釋放AMP，使得酶重新具有催化功能。在吲哚霉素抑制TrpRS實(shí)驗(yàn)中，研究人員用羥胺作為替代終受體以研究第一步的反應(yīng)速率，酶在此反應(yīng)中高效地激活Trp且不斷生成PPi。PPi被焦磷酸酶分解成磷酸根（Pi），用孔雀石綠試劑或EnzChek試劑盒可以測定Pi的生成來定量第一步反應(yīng)的速率及酶活（圖2 A-C）。研究人員測定了吲哚霉素針對Mtb TrpRS的IC50和Ki分別是1.0和0.34μM（圖2 D-E），說明吲哚霉素對Mtb TrpRS具有較高結(jié)合和抑制作用。
?Figure 2?Assay validation of PPi production in Mtb TrpRS reaction
?
另一方面，文章解析了Mtb TrpRS單體蛋白和蛋白與底物或吲哚霉素的共晶結(jié)構(gòu)，深入揭示了吲哚霉素的抑制機(jī)理。研究表明蛋白在無底物狀態(tài)下呈現(xiàn)開放態(tài)（open state），蛋白與中間體Trp-AMP結(jié)合后呈現(xiàn)閉合態(tài)（closed state），而吲哚霉素與蛋白和ATP的共晶結(jié)構(gòu)顯示蛋白處在開放和閉合之間的中間態(tài)（圖3 A）。比較三種狀態(tài)下的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，ATP與Trp結(jié)合位點(diǎn)均有不同程度的改變（圖3 B-F），為下一步解釋化合物的構(gòu)效關(guān)系（SAR）和合理設(shè)計(jì)TrpRS抑制劑提供了基礎(chǔ)。
?Figure 3?The structures and co-crystal structures of Mtb TrpRS
?
三、吲哚霉素類似物的化學(xué)合成和SAR探索
?
吲哚霉素結(jié)構(gòu)由3個組成部分：藍(lán)色的吲哚環(huán)、中間綠色的雜環(huán)和紅色的尾側(cè)鏈。該研究對吲哚霉素不同部分的基團(tuán)修飾和改變可能對其活性的影響進(jìn)行了充分的探討，設(shè)計(jì)并合成了28個吲哚霉素類似物（具體過程見原文），并利用表面等離子共振（SAR）技術(shù)對這些化合物的酶活進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，在吲哚環(huán)的R1位引入一些取代基團(tuán)，均能提高吲哚霉素類似物對Mtb TrpRS酶活能力和抑制結(jié)核分枝桿菌生長的能力，尤其是4’-甲基化的類似物Y-13分別在酶活和MIC上至少提高了3倍和6倍（表1）。
?Table 1?Antimycobacterial activity of IND derivatives against M.bovis BCG and Mtb H37Rv
?
研究人員用蛋白和配體復(fù)合物的共晶結(jié)構(gòu)（圖4）解釋了吲哚環(huán)C-4上引入疏水的基團(tuán)（F，Cl和CH3），能夠提高吲哚霉素類似物抗菌活性的原因。雖然這些蛋白復(fù)合體整體結(jié)構(gòu)類似，但在不同C-4位取代下的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)有差異。相對于吲哚霉素，C-4位F和Cl的取代類似物能夠更好地適合空間，而在Br取代中，可能由于過大的原子半徑，使得Br與Q156殘基產(chǎn)生了空間位阻。在甲基取代的結(jié)構(gòu)中，不僅甲基基團(tuán)非常好的匹配了空間，同時3個C-H鍵也與側(cè)鏈的Q156殘基形成弱氫鍵結(jié)合（圖4F）。
?Figure 4?Structure analysis of the C-4’substituted IND series compounds
四、吲哚霉素在結(jié)核分枝桿菌中對TrpRS的靶向性分析
?
該研究構(gòu)建ATc誘導(dǎo)表達(dá)TrpRS的BCG牛分枝桿菌，用來分析吲哚霉素及其類似物Y-13的MIC變化。與不受誘導(dǎo)相比較，在1μg/ml ATc的誘導(dǎo)下，吲哚霉素的MIC由19μM提高到了4.8mM；Y-13的MIC由11μM提高到了38μM。同樣條件下，對照菌株無論是否含有誘導(dǎo)劑均不會引起MIC的改變，從而證明吲哚霉素及其類似物在結(jié)核分枝桿菌中具有相同的靶點(diǎn)TrpRS（圖5）。
五、吲哚霉素藥物聯(lián)用的殺菌活性分析
?
通過對牛分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)研究，研究人員測定了Y-13與多種抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用的殺菌情況。計(jì)算得出部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）和等效線圖（表2和圖6），發(fā)現(xiàn)Y-13與TrpE變構(gòu)抑制劑IPA聯(lián)用具有最好的協(xié)同效應(yīng)，F(xiàn)ICI達(dá)到了0.31。在測試的所有藥物中沒有發(fā)現(xiàn)拮抗劑。研究人員又對Y-13-IPA和Y-13-GSK656（LeuRS抑制劑）的協(xié)同用藥通過菌落計(jì)數(shù)的方式進(jìn)行了24d的生長監(jiān)測（圖7）。結(jié)果顯示Y-13與IPA聯(lián)用降低了15倍的菌落數(shù)，而殺菌效果是在14d后才逐漸顯示出來，提示吲哚霉素對長期培養(yǎng)生長的分枝桿菌的代謝具有繼發(fā)性影響。
▲?Table 2?FICIs of pairwise combinations of Y-13 with TB drugs?in vitro
?
Figure 6?Isobolograms of Y-13 in combination with IPA and streptomycin
?
?Figure 7?In vitro?kill kinetics of growth inhibitors against?M. bovis BCG
?
六、分枝桿菌對吲哚霉素及其類似物耐藥性的分析
?
研究分析了吲哚霉素及其類似物引起分枝桿菌的自發(fā)突變率。在固體培養(yǎng)基中，分別設(shè)置了2倍、4倍和8倍MIC的藥物使用劑量。吲哚霉素及其類似物引起的細(xì)菌自發(fā)突變率都在10-8到10-9，優(yōu)于GSK656，遠(yuǎn)好于異煙肼（表3）。分離的5個具有吲哚霉素抗性生長較快的恥垢分枝桿菌（Msmeg）菌株中，4個Msmeg菌株的trpS基因發(fā)生了H49N的突變（相對于結(jié)核分枝桿菌的第50位組氨酸）。結(jié)構(gòu)分析顯示：H50N的突變能夠破壞π?πstacking與D141氫鍵的形成，從而影響吲哚霉素與TrpRS的結(jié)合。而在分離的19個有吲哚霉素抗性但生長慢的牛分枝桿菌菌株中，trpS及其上游序列均未發(fā)生突變。為此研究選擇了5個牛分枝桿菌耐藥突變株進(jìn)行了全基因組測序，對發(fā)現(xiàn)的6種突變基因（表4）歸納為以下3種類型：涉及色氨酸生物合成的TrpE和CM（分支酸變位酶）、涉及脂肪酸生物合成和細(xì)胞壁脂代謝的PpsA和TesA，以及涉及中心碳代謝和細(xì)胞呼吸功能的GlpK和FrdC。這些基因突變可以用來解釋慢生長分枝桿菌對吲哚霉素類似物產(chǎn)生抗藥性和耐藥性的原因，并提示結(jié)核分枝桿菌嚴(yán)格控制其細(xì)菌胞內(nèi)的色氨酸合成。
?Table 3?Frequency of spontaneous resistant mutants of M. bovis BCG raised against the compound
?
?Table 4?Mutations in the IND resistant mutants of M.bovis BCG, identified by whole-genome sequencing
?
研究結(jié)論
研究按照基因組挖掘鏈霉菌天然產(chǎn)物的邏輯，尋找具有生物活性和特異靶點(diǎn)的抗結(jié)核先導(dǎo)化合物。研究者以抑制Mtb TrpRS的吲哚霉素為例建立并展示了相關(guān)技術(shù)路線和平臺，包括功能性生化測試、化學(xué)合成及化合物構(gòu)效關(guān)系、蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析、細(xì)胞活性和毒性測試、細(xì)菌內(nèi)靶向分析、細(xì)菌抗藥體外發(fā)生頻率、細(xì)菌抗藥機(jī)理，以及對與抗結(jié)核藥物體外聯(lián)用的評價等。雖然改進(jìn)后的吲哚霉素類似物具有較好的體外抗結(jié)核活性，并且其他很多物化指標(biāo)也均達(dá)到了口服藥物標(biāo)準(zhǔn)（如口服抗幽門螺桿菌藥物），其專一的抗菌譜也意味著未來吲哚霉素類藥物可能僅限于治療慢生長非結(jié)核分枝桿菌感染。另一方面，成千上萬的鏈霉菌基因組已經(jīng)被測序并存放在公共數(shù)據(jù)庫里，各類型鏈霉放線菌菌種收藏中心早已建立，現(xiàn)在從事抗結(jié)核早期藥物開發(fā)的研究人員完全可以通過本文的方法找到作用于遺傳信息傳遞鏈里的靶點(diǎn)，以及具有很好細(xì)胞活性的先導(dǎo)化合物。
?
?
研究背景
?
在新型冠狀病毒肺炎全球大流行的背景下，人類結(jié)核病的感染和病亡率也在不斷升高，社會對抗結(jié)核藥物的研發(fā)有著更為緊迫的要求。吲哚霉素（indolmycin，IND）是灰色鏈霉菌產(chǎn)生的天然抗生素，它能選擇性地抑制病原細(xì)菌的色氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶TrpRS，但未見對動物細(xì)胞的毒副作用。TrpRS是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)蛋白合成的必需關(guān)鍵酶，它與近年來引起關(guān)注的一系列色氨酸生物合成酶都是開發(fā)新型抗結(jié)核藥物的重要靶點(diǎn)。基于作者對鏈霉菌天然產(chǎn)物和色氨酰tRNA合成酶抑制劑的研究經(jīng)驗(yàn)，本研究首次詳細(xì)揭示了吲哚霉素對分枝桿菌的抑菌活性和分子水平的作用機(jī)理，以及分枝桿菌可能產(chǎn)生的抗藥頻率和及其機(jī)理等。該研究通過建立生化實(shí)驗(yàn)分析了多種全化學(xué)合成的吲哚霉素類似物，發(fā)現(xiàn)多個類似物的最低抑菌濃度（MIC）較起始天然產(chǎn)物降低了7～14倍。其中，4’-甲基化吲哚霉素（Y-13）的MIC較穩(wěn)定，且達(dá)到0.5μg/ml，并能與色氨酸生物合成途徑中TrpE的變構(gòu)抑制劑吲哚丙酸（IPA）產(chǎn)生協(xié)同作用，能更有效地殺死體外分枝桿菌，提示針對病原體色氨酸合成和蛋白合成途徑設(shè)計(jì)雙重抑制，能開發(fā)一類新型抗生素有效應(yīng)對耐藥結(jié)核分枝桿菌。
研究方法
通過異源表達(dá)純化獲得Mtb TrpRS蛋白，建立新型的不依賴于tRNA的生化實(shí)驗(yàn)以分析Mtb TrpRS的酶活性。同時，系統(tǒng)地分析了吲哚霉素對多種分枝桿菌（如Mtb、BCG和Msmeg等）的體外抑菌濃度，對哺乳動物細(xì)胞的毒性，以及對Mtb TrpRS的多種生化參數(shù)（IC50，Ki和KD）。吲哚霉素及光學(xué)純類似物經(jīng)改良的5步化學(xué)全合成路線制備。TrpRS蛋白與化合物在2.5?分辨率的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)中也被詳盡解析，作為建立結(jié)構(gòu)和活性相關(guān)性的基礎(chǔ)。在相關(guān)細(xì)菌學(xué)研究中，建立過量表達(dá)trpS基因的BCG菌株可以對化合物進(jìn)行靶向分析，還可以對其聯(lián)合用藥的協(xié)調(diào)作用進(jìn)行分析，也可以進(jìn)行時間依賴的動態(tài)殺菌檢測實(shí)驗(yàn)，對體外篩選的BCG菌株和Msmeg抗吲哚霉素類似物突變株及其基因組進(jìn)行測序。
?
研究結(jié)果
一、對天然產(chǎn)物吲哚霉素的初步評價
?
天然產(chǎn)物吲哚霉素對慢生長非結(jié)核分枝桿菌的MIC約為4μg/ml；只抑制少數(shù)病原菌生長，對革蘭氏陰性菌和大部分腸道細(xì)菌沒有作用；在10倍MIC濃度下對動物細(xì)胞沒有毒性。它的生化和物理化學(xué)指標(biāo)均達(dá)到了做藥物先導(dǎo)化合物的要求。
?Figure 1.??Structure of IND and initial assessments
?
?
TrpRS酶活反應(yīng)分為兩步：第一步，消耗ATP激活氨基酸，ATP和氨基酸在酶的催化下生成Trp-AMP和焦磷酸（PPi），中間體Trp-AMP與酶有高親和力的結(jié)合；第二步，以tRNA為受體，接收中間體中酰化的氨基酸的轉(zhuǎn)移，生成Trp-tRNA并釋放AMP，使得酶重新具有催化功能。在吲哚霉素抑制TrpRS實(shí)驗(yàn)中，研究人員用羥胺作為替代終受體以研究第一步的反應(yīng)速率，酶在此反應(yīng)中高效地激活Trp且不斷生成PPi。PPi被焦磷酸酶分解成磷酸根（Pi），用孔雀石綠試劑或EnzChek試劑盒可以測定Pi的生成來定量第一步反應(yīng)的速率及酶活（圖2 A-C）。研究人員測定了吲哚霉素針對Mtb TrpRS的IC50和Ki分別是1.0和0.34μM（圖2 D-E），說明吲哚霉素對Mtb TrpRS具有較高結(jié)合和抑制作用。
?Figure 2?Assay validation of PPi production in Mtb TrpRS reaction
另一方面，文章解析了Mtb TrpRS單體蛋白和蛋白與底物或吲哚霉素的共晶結(jié)構(gòu)，深入揭示了吲哚霉素的抑制機(jī)理。研究表明蛋白在無底物狀態(tài)下呈現(xiàn)開放態(tài)（open state），蛋白與中間體Trp-AMP結(jié)合后呈現(xiàn)閉合態(tài)（closed state），而吲哚霉素與蛋白和ATP的共晶結(jié)構(gòu)顯示蛋白處在開放和閉合之間的中間態(tài)（圖3 A）。比較三種狀態(tài)下的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，ATP與Trp結(jié)合位點(diǎn)均有不同程度的改變（圖3 B-F），為下一步解釋化合物的構(gòu)效關(guān)系（SAR）和合理設(shè)計(jì)TrpRS抑制劑提供了基礎(chǔ)。
?Figure 3?The structures and co-crystal structures of Mtb TrpRS
三、吲哚霉素類似物的化學(xué)合成和SAR探索
?
吲哚霉素結(jié)構(gòu)由3個組成部分：藍(lán)色的吲哚環(huán)、中間綠色的雜環(huán)和紅色的尾側(cè)鏈。該研究對吲哚霉素不同部分的基團(tuán)修飾和改變可能對其活性的影響進(jìn)行了充分的探討，設(shè)計(jì)并合成了28個吲哚霉素類似物（具體過程見原文），并利用表面等離子共振（SAR）技術(shù)對這些化合物的酶活進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，在吲哚環(huán)的R1位引入一些取代基團(tuán)，均能提高吲哚霉素類似物對Mtb TrpRS酶活能力和抑制結(jié)核分枝桿菌生長的能力，尤其是4’-甲基化的類似物Y-13分別在酶活和MIC上至少提高了3倍和6倍（表1）。
?Table 1?Antimycobacterial activity of IND derivatives against M.bovis BCG and Mtb H37Rv
?
?Figure 4?Structure analysis of the C-4’substituted IND series compounds
四、吲哚霉素在結(jié)核分枝桿菌中對TrpRS的靶向性分析
?
該研究構(gòu)建ATc誘導(dǎo)表達(dá)TrpRS的BCG牛分枝桿菌，用來分析吲哚霉素及其類似物Y-13的MIC變化。與不受誘導(dǎo)相比較，在1μg/ml ATc的誘導(dǎo)下，吲哚霉素的MIC由19μM提高到了4.8mM；Y-13的MIC由11μM提高到了38μM。同樣條件下，對照菌株無論是否含有誘導(dǎo)劑均不會引起MIC的改變，從而證明吲哚霉素及其類似物在結(jié)核分枝桿菌中具有相同的靶點(diǎn)TrpRS（圖5）。
?
?Figure 5?Dose-response profile of recombinant strains against IND and Y-13 in the absence or presence of ATc
??Figure 5?Dose-response profile of recombinant strains against IND and Y-13 in the absence or presence of ATc
五、吲哚霉素藥物聯(lián)用的殺菌活性分析
?
通過對牛分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)研究，研究人員測定了Y-13與多種抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用的殺菌情況。計(jì)算得出部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）和等效線圖（表2和圖6），發(fā)現(xiàn)Y-13與TrpE變構(gòu)抑制劑IPA聯(lián)用具有最好的協(xié)同效應(yīng)，F(xiàn)ICI達(dá)到了0.31。在測試的所有藥物中沒有發(fā)現(xiàn)拮抗劑。研究人員又對Y-13-IPA和Y-13-GSK656（LeuRS抑制劑）的協(xié)同用藥通過菌落計(jì)數(shù)的方式進(jìn)行了24d的生長監(jiān)測（圖7）。結(jié)果顯示Y-13與IPA聯(lián)用降低了15倍的菌落數(shù)，而殺菌效果是在14d后才逐漸顯示出來，提示吲哚霉素對長期培養(yǎng)生長的分枝桿菌的代謝具有繼發(fā)性影響。
▲?Table 2?FICIs of pairwise combinations of Y-13 with TB drugs?in vitro
Figure 6?Isobolograms of Y-13 in combination with IPA and streptomycin
?Figure 7?In vitro?kill kinetics of growth inhibitors against?M. bovis BCG
六、分枝桿菌對吲哚霉素及其類似物耐藥性的分析
?
研究分析了吲哚霉素及其類似物引起分枝桿菌的自發(fā)突變率。在固體培養(yǎng)基中，分別設(shè)置了2倍、4倍和8倍MIC的藥物使用劑量。吲哚霉素及其類似物引起的細(xì)菌自發(fā)突變率都在10-8到10-9，優(yōu)于GSK656，遠(yuǎn)好于異煙肼（表3）。分離的5個具有吲哚霉素抗性生長較快的恥垢分枝桿菌（Msmeg）菌株中，4個Msmeg菌株的trpS基因發(fā)生了H49N的突變（相對于結(jié)核分枝桿菌的第50位組氨酸）。結(jié)構(gòu)分析顯示：H50N的突變能夠破壞π?πstacking與D141氫鍵的形成，從而影響吲哚霉素與TrpRS的結(jié)合。而在分離的19個有吲哚霉素抗性但生長慢的牛分枝桿菌菌株中，trpS及其上游序列均未發(fā)生突變。為此研究選擇了5個牛分枝桿菌耐藥突變株進(jìn)行了全基因組測序，對發(fā)現(xiàn)的6種突變基因（表4）歸納為以下3種類型：涉及色氨酸生物合成的TrpE和CM（分支酸變位酶）、涉及脂肪酸生物合成和細(xì)胞壁脂代謝的PpsA和TesA，以及涉及中心碳代謝和細(xì)胞呼吸功能的GlpK和FrdC。這些基因突變可以用來解釋慢生長分枝桿菌對吲哚霉素類似物產(chǎn)生抗藥性和耐藥性的原因，并提示結(jié)核分枝桿菌嚴(yán)格控制其細(xì)菌胞內(nèi)的色氨酸合成。
?Table 3?Frequency of spontaneous resistant mutants of M. bovis BCG raised against the compound
?
?Table 4?Mutations in the IND resistant mutants of M.bovis BCG, identified by whole-genome sequencing
研究結(jié)論
研究按照基因組挖掘鏈霉菌天然產(chǎn)物的邏輯，尋找具有生物活性和特異靶點(diǎn)的抗結(jié)核先導(dǎo)化合物。研究者以抑制Mtb TrpRS的吲哚霉素為例建立并展示了相關(guān)技術(shù)路線和平臺，包括功能性生化測試、化學(xué)合成及化合物構(gòu)效關(guān)系、蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析、細(xì)胞活性和毒性測試、細(xì)菌內(nèi)靶向分析、細(xì)菌抗藥體外發(fā)生頻率、細(xì)菌抗藥機(jī)理，以及對與抗結(jié)核藥物體外聯(lián)用的評價等。雖然改進(jìn)后的吲哚霉素類似物具有較好的體外抗結(jié)核活性，并且其他很多物化指標(biāo)也均達(dá)到了口服藥物標(biāo)準(zhǔn)（如口服抗幽門螺桿菌藥物），其專一的抗菌譜也意味著未來吲哚霉素類藥物可能僅限于治療慢生長非結(jié)核分枝桿菌感染。另一方面，成千上萬的鏈霉菌基因組已經(jīng)被測序并存放在公共數(shù)據(jù)庫里，各類型鏈霉放線菌菌種收藏中心早已建立，現(xiàn)在從事抗結(jié)核早期藥物開發(fā)的研究人員完全可以通過本文的方法找到作用于遺傳信息傳遞鏈里的靶點(diǎn)，以及具有很好細(xì)胞活性的先導(dǎo)化合物。
?
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請聯(lián)系我們及時修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com