林章凜教授課題組在ACS Synthetic Biology雜志上發(fā)表論文— 谷氨酸棒桿菌基因組合成大片段DNA迭代替換
基因組的合理設(shè)計與合成可加深我們對基因組結(jié)構(gòu)、功能和進化的理解。目前已成功構(gòu)建生殖支原體、大腸桿菌、釀酒酵母的合成基因組。谷氨酸棒狀桿菌是公認安全（GRAS）的重要微生物細胞工廠，對其進行基因組合成將有助于更好地設(shè)計和改造菌種，但其基因組合成存在基因重疊較多、大片段導(dǎo)入困難、重組（替換）效率低等障礙進展緩慢。近日，作為谷氨酸棒狀桿菌全基因組合成的預(yù)研實驗，華南理工大學生物科學與工程學院林章凜課題組的葉燕銳副教授和華大生命科學研究院沈玥課題組的王云博士等通過RecE/RecT介導(dǎo)的同源重組方法將53.4 kb原始菌株基因組替換為了55.1 kb合成基因組，文章發(fā)表于ACS Synthetic Biology題為：Genomic Iterative Replacements of Large Synthetic DNA Fragments in Corynebacterium glutamicum。
研究者以谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032 為研究對象，選取了54.3 kb 基因組區(qū)域(3,156,174 – 3,210,459，無插入序列元件) 為目標替換序列。合成基因組參照酵母合成基因組計劃：1. 接近野生型的表現(xiàn)型和適應(yīng)性; 2. 缺乏破壞穩(wěn)定的因素;3. 具有遺傳靈活性，以促進未來的研究。遵循此原則，研究者重設(shè)計目標基因組：1. 將目標區(qū)域內(nèi)的重疊基因進行解耦；2. 為提高基因組的靈活性，將所有TAG 更改為TAA 釋放了一個密碼子，并在20個終止密碼子3 bp 后插入了loxPsym位點；3. 為區(qū)別合成型序列和野生型序列，引入了80對PCRTags作為DNA水印。相對于野生型序列，重新設(shè)計的基因組序列有27個插入點（共855 bp）和849個單核苷酸替換點，合成的序列被打斷為4-9 kb的片段，并在每個片段后添加了卡那霉素或壯觀霉素抗性基因和一個500 bp的同源臂序列，最終化學合成的序列長度為55,141 bp。
為最終獲得無抗性的合成基因組，研究者將谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032 編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因突變?yōu)?span>rpsLK43R，使其具有鏈霉素抗性，當存在另一拷貝野生型rpsL時，會喪失鏈霉素抗性，并在合成基因組最后一個片段上添加rpsL，通過鏈霉素反篩獲得無抗菌株。
目前，已報道3 對重組酶在谷氨酸棒狀桿菌中可正常行使功能，其中 ?RecE/RecT 重組效率最高。研究者通過質(zhì)粒引入RecE/RecT 重組酶，通過每個片段所攜帶的抗性對正確重組的菌株進行篩選，迭代將原始基因組替換為合成的基因組，最后再通過鏈霉素反篩獲得了最終無標記的55.1 kb 基因組替換的谷氨酸棒狀桿菌（原理如圖）。
通過PCRTags對每一次重組的效率進行計算，正確的重組率在1%-14%，最大替換長度為10 kb。經(jīng)測試，替換后的谷氨酸棒狀桿菌可在無抗培養(yǎng)基穩(wěn)定傳代超100代，其表型在所測試的生長條件下（酸、堿、氧脅迫）生長狀況均相同，只有在1 M NaCl 情況下基因組替換的菌株生長狀態(tài)更優(yōu)。最后，研究者通過誘導(dǎo)4 h或8 h表達重組酶，驗證了所插入loxPsym位點可實現(xiàn)基因組缺失（30 kb）、倒位和易位，體現(xiàn)了合成型谷氨酸棒狀桿菌基因組的遺傳可塑性。
綜上，本文建立了一種基于同源重組的谷氨酸棒狀桿菌基因組迭代替換方法，為谷氨酸棒狀桿菌的基因組合成和代謝工程研究提供了新思路。
該研究得到了國家重點研發(fā)專項（2017YFC1601202）等項目的支持。
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