yle="margin-top: 4px; text-indent: 32px; line-height: 25px; text-align: justify;">近日,北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室王晶團(tuán)隊在學(xué)術(shù)期刊《Angewandte Chemie International Edition》發(fā)表了題為“Monitoring the Dynamic Regulation of the Mitochondrial GTP-to-GDP Ratio with a Genetically Encoded Fluorescent Biosensor”(開發(fā)遺傳編碼的生物熒光探針監(jiān)測線粒體中GTP與GDP比值的動態(tài)變化)的研究工作。
GTP和GDP的代謝和轉(zhuǎn)化在廣泛的生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,能夠為生物合成提供能量,或參與廣泛的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。GTP和GDP的代謝和轉(zhuǎn)化廣泛存在于這些相關(guān)的生理過程或病理過程中,通常由復(fù)雜的酶系統(tǒng)調(diào)節(jié),因而GTP/GDP比值可以作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝狀態(tài)變化的敏感且重要的指標(biāo)。然而,針對GTP和GDP比值指標(biāo)的活細(xì)胞動態(tài)監(jiān)測始終是一項極具挑戰(zhàn)性的難題。更為重要的是,相比較檢測GTP或GDP絕對濃度獲得的能量代謝的信息,精準(zhǔn)檢測細(xì)胞內(nèi)GTP與GDP的相對濃度可以更好地解釋鳥苷酸能量代謝變化的生物學(xué)意義。因此,發(fā)展一種光學(xué)工具來實時報告活細(xì)胞的GTP/GDP比率具有非常重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。
基于此,北京大學(xué)藥學(xué)院王晶團(tuán)隊,利用遺傳編碼的熒光蛋白傳感器技術(shù)實現(xiàn)了對GTP/GDP比率的時空特異性和實時動態(tài)監(jiān)測。探針設(shè)計選擇Ct-eIF5B的結(jié)構(gòu)域Ⅰ作為“GTP/GDP感知元件”,繼而將“報告元件”循環(huán)重排黃色熒光蛋白(cpYFP)插入到Ct-EIF5B的結(jié)構(gòu)域Ⅰ中,cpYFP會對其N端或C端的蛋白結(jié)構(gòu)變化敏感,當(dāng)GTP或GDP與該融合蛋白(GRIser)結(jié)合后,會誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象變化,從而產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號。
此外本研究利用計算機(jī)輔助設(shè)計和蛋白分子定向進(jìn)化技術(shù),對該GTP/GDP比值的熒光探針進(jìn)行了深度優(yōu)化。通過對突變位點設(shè)計高效完整的篩選工作流程,并綜合評價各個突變體的響應(yīng)幅度、親和力等體外特征,開發(fā)了性能優(yōu)良的遺傳編碼的GTP/GDP比值的熒光探針(GRIserHR)。GRIserHR具有極好的熒光穩(wěn)定性、選擇性和敏感性(亞微摩爾)。隨后,該團(tuán)隊通過引入適當(dāng)?shù)男盘栯呐c傳感器融合,構(gòu)建得到GRIserHR的突變體,從而實現(xiàn)了對活細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞區(qū)室中的GTP/GDP比值的監(jiān)測,為實時動態(tài)研究活細(xì)胞中亞細(xì)胞尺度的GTP/GDP比值奠定了堅實基礎(chǔ)。
同時,該團(tuán)隊還將GRIserHR用于探究PEPCK-M和SCS酶功能擾動后是如何差異性地調(diào)控胞質(zhì)和線粒體GTP/GDP比值的水平。實驗結(jié)果表明線粒體中GTP/GDP比值獨立于細(xì)胞質(zhì)GTP/GDP比值的變化??傊?,利用GRIserHR探針可以加強(qiáng)對線粒體代謝機(jī)制的深入理解,以及通過發(fā)現(xiàn)影響 GTP-GDP相互轉(zhuǎn)換的特異性靶標(biāo),展開激活劑和抑制劑的高通量篩選工作。本工作也為GTP/GDP比值作為代謝動態(tài)指標(biāo)提供了確鑿的證據(jù),進(jìn)一步完善了中心碳代謝分子研究的監(jiān)測工具庫。
北京大學(xué)藥學(xué)院研究員王晶研究員為本研究論文的通訊作者。北京大學(xué)藥學(xué)院博士研究生張美琪和北京大學(xué)藥學(xué)院六年制研究生楊波為論文的共同第一作者。該工作得到科技部重點研發(fā)計劃和國家自然科學(xué)基金委等項目資助。
左起:張美琪(博士研究生),王晶(研究員),楊波(六年制碩士研究生)
原文鏈接:https://doi.org/10.1002/anie.202201266
王晶,博士,北京大學(xué)藥學(xué)院研究員、博士生導(dǎo)師、天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室PI。入選國家海外高層次人才計劃。長期致力于利用化學(xué)生物學(xué)方法研究小分子對生物大分子的調(diào)控機(jī)制和開發(fā)相應(yīng)的基于遺傳編碼的生物熒光探針。至今以第一作者或通訊作者身份在Nat. Chem.、Nat. Biotechnol.、Angew. Chem. Int. Ed. 等國際重要學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。
天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室?供稿
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