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近日，北京大學(xué)深圳研究生院李子剛/尹豐課題組在中國(guó)化學(xué)會(huì)旗艦期刊《CCS Chemistry》發(fā)表了題為“A proximity-triggered strategy towards transferable PROTACs”的研究論文。該論文通過(guò)配體導(dǎo)向化學(xué)，開(kāi)發(fā)了一種基于锍鹽分子的“基團(tuán)轉(zhuǎn)移”策略用于靶標(biāo)蛋白半胱氨酸（Cysteine，Cys）的位點(diǎn)選擇性修飾。“基團(tuán)轉(zhuǎn)移”策略成功地用于PROTAC領(lǐng)域顯示出該策略的實(shí)用性，當(dāng)作者將“轉(zhuǎn)移基團(tuán)”稍加改造，該策略即可被用于更多化學(xué)生物學(xué)的研究，諸如PTM研究，活細(xì)胞成像以及蛋白質(zhì)組學(xué)研究等等。

圖一、基于硫鹽中心的“基團(tuán)轉(zhuǎn)移”策略用于“可轉(zhuǎn)移PROTAC”示意圖

EGFR是NSCLC診斷和治療研究的最重要藥物靶點(diǎn)之一。EGFR-TKIs雖然對(duì)治療NSCLC有顯著療效，但其維持時(shí)間短，絕大多數(shù)EGFR TKIs治療有效的患者最終都會(huì)復(fù)發(fā)耐藥，成為了當(dāng)前臨床肺癌治療面對(duì)的巨大挑戰(zhàn)。PROTAC是藥物研發(fā)領(lǐng)域的一個(gè)新興方向，其目的不是抑制靶標(biāo)而是誘導(dǎo)靶標(biāo)蛋白通過(guò)UPS（泛素-蛋白酶體系統(tǒng)）被降解，為解決小分子抑制劑的耐藥性問(wèn)題帶來(lái)了希望。PROTACs由三部分組成，通過(guò)中間的連接基團(tuán)將一個(gè)靶標(biāo)蛋白的配體和一個(gè)特異性招募E3連接酶的配體連到一起。因此，PROTACs可以同時(shí)結(jié)合目標(biāo)蛋白和E3連接酶，進(jìn)而形成目標(biāo)蛋白-PROTACs-E3連接酶三元復(fù)合物。PROTACs劫持E3連接酶，將目標(biāo)蛋白多聚泛素化，通過(guò)UPS選擇性降解目標(biāo)蛋白。然而傳統(tǒng)PROTACs分子的設(shè)計(jì)合成比較繁瑣，為其后續(xù)的生物研究以及臨床應(yīng)用帶來(lái)困難。

李子剛/尹豐課題組前期發(fā)展了一種側(cè)鏈硫鹽穩(wěn)定多肽對(duì)蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾策略。由此出發(fā)，作者設(shè)想能否將锍鹽中心引入到PROTACs分子的設(shè)計(jì)當(dāng)中，發(fā)展一種簡(jiǎn)單易得，適用于任何“蛋白質(zhì)-抑制劑”系統(tǒng)的锍鹽工具用于快速判斷特定靶標(biāo)的降解效率。于是作者在Osimertinib配體上引入锍鹽中心，希望在Osimertinib導(dǎo)向下，通過(guò)鄰近靶標(biāo)Cys對(duì)硫鹽中心的親核進(jìn)攻，發(fā)生基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，將锍鹽中心上的功能基團(tuán)Thalidomide轉(zhuǎn)移到靶標(biāo)蛋白上，形成“靶標(biāo)-Thalidomide”偶聯(lián)物，實(shí)現(xiàn)UPS誘導(dǎo)的EGFR降解。

首先，作者對(duì)锍鹽的合成進(jìn)行了簡(jiǎn)單摸索，Osimertinib和硫醇通過(guò)邁克爾加成生成硫醚，接著在弱酸性下與芐基溴取代生成锍鹽分子?；瘜W(xué)上，作者通過(guò)原位NMR確定了高濃度的芐基二甲基锍鹽（10 mM）和Ac-Cys-OH（50 mM）之間的反應(yīng)性。Ac-Cys-OH上親核性巰基能進(jìn)攻芐基二甲基锍鹽上的芐基，發(fā)生“基團(tuán)轉(zhuǎn)移”反應(yīng)，得到芐基化Ac-Cys-OH產(chǎn)物。于是，作者合成了一系列帶有芐基接頭的锍鹽，探索其和重組EGFR的反應(yīng)。膠內(nèi)熒光實(shí)驗(yàn)和DFT計(jì)算都驗(yàn)證了帶有芐基的疊氮基團(tuán)轉(zhuǎn)移到重組EGFR上。除了簡(jiǎn)單的正交基團(tuán)，帶有芐基接頭的Cy5熒光基團(tuán)也能被轉(zhuǎn)移到重組EGFR上。為了探究基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)的化學(xué)特性，作者合成了帶有其他接頭的生物素硫鹽，通過(guò)WB驗(yàn)證芐基接頭表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)移效率。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明導(dǎo)向配體對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別對(duì)“基團(tuán)轉(zhuǎn)移”反應(yīng)的發(fā)生與否至關(guān)重要。不同激酶的WB結(jié)果驗(yàn)證了反應(yīng)的靶標(biāo)選擇性。最后，LC-MS/MS確定了1-IX可以位點(diǎn)選擇性標(biāo)記重組EGFR的Cys775。

為了探究該基團(tuán)轉(zhuǎn)移策略能否適用于PROTAC領(lǐng)域，作者合成了帶有CRBN配體的锍鹽降解子1-X。通過(guò)WB發(fā)現(xiàn)1-X對(duì)EGFR的降解效果隨著藥量和時(shí)間的增加而加強(qiáng)。由于1-X跟EGFR結(jié)合后才會(huì)觸發(fā)基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，而通常認(rèn)為EGFR的降解在結(jié)合階段就能發(fā)生，為了進(jìn)一步探究降解發(fā)生的原因，作者合成了幾個(gè)對(duì)照分子。沒(méi)有EGFR結(jié)合配體的5以及沒(méi)有CRBN結(jié)合配體的8無(wú)法降低EGFR表達(dá)水平，更重要的是，擁有雙配體的硫醚分子6、1-X水解產(chǎn)物7和9未能降解EGFR證實(shí)了EGFR的降解是通過(guò)轉(zhuǎn)移Thalidomide基團(tuán)引起的。

為了驗(yàn)證降解是由CRBN介導(dǎo)的，作者用帶有甲基化修飾的Thalidomide（1-XIII）和帶有芐基化修飾的Thalidomide（1-XIV）作為陰性對(duì)照處理A549細(xì)胞。陰性對(duì)照未能降解EGFR，這證實(shí)了EGFR的降解是由CRBN介導(dǎo)的。為了探究1-X誘導(dǎo)EGFR降解是否通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑，作者用MLN-4924抑制劑或Thalidomide競(jìng)爭(zhēng)劑預(yù)處理細(xì)胞后EGFR沒(méi)有降解，說(shuō)明降解是由E1和E3介導(dǎo)的。作者將帶有HA標(biāo)簽的泛素表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，并加藥處理細(xì)胞，免疫沉淀（IP-WB）檢測(cè)泛素化EGFR蛋白。1-X處理樣品的泛素化EGFR水平高于沒(méi)有1-X處理的樣品，說(shuō)明1-X介導(dǎo)的EGFR降解伴隨著EGFR的泛素化。進(jìn)一步得，作者發(fā)現(xiàn)加入蛋白酶體抑制劑MG-132可以減緩1-X誘導(dǎo)的EGFR的降解，說(shuō)明該降解是通過(guò)蛋白酶體途徑發(fā)生的。綜上表明1-X誘導(dǎo)的EGFR降解是通過(guò)“泛素-蛋白酶體”途徑發(fā)生的。最后，作者通過(guò)RT-PCR表明1-X誘導(dǎo)的EGFR降解是發(fā)生在蛋白質(zhì)水平的。

為了探究硫鹽分子的生物學(xué)功能。作者通過(guò)HTRF確定1-IX可以抑制EGFR磷酸化。由于EGFR磷酸化被抑制會(huì)阻斷EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。于是作者通過(guò)MTT驗(yàn)證了1-IX/1-X對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。1-X抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)可能是由于1-X誘導(dǎo)的EGFR降解導(dǎo)致的。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了1-IX/1-X誘導(dǎo)了肺癌細(xì)胞的G0/G1周期停滯和中后期凋亡。為了擴(kuò)展基團(tuán)轉(zhuǎn)移策略的普適性，作者合成了帶有Adamantane功能基團(tuán)的锍鹽分子1-XV。通過(guò)另一種蛋白降解策略（HyT）使用疏水標(biāo)簽來(lái)模擬部分變性的蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)，從而誘導(dǎo)分子伴侶介導(dǎo)蛋白酶體降解。1-XV對(duì)EGFR的降解效果隨著時(shí)間和藥量的增加而加強(qiáng)。

總之，通過(guò)配體導(dǎo)向的鄰近效應(yīng)，作者開(kāi)發(fā)了一種基于锍鹽中心的“基團(tuán)轉(zhuǎn)移”策略對(duì)蛋白質(zhì)Cys進(jìn)行位點(diǎn)選擇性修飾，該策略成功應(yīng)用于PROTACs領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了UPS途徑的EGFR靶向降解。該可轉(zhuǎn)移PROTACs和其他共價(jià)PROTACs都沒(méi)法實(shí)現(xiàn)催化再循環(huán)，這導(dǎo)致了至少化學(xué)計(jì)量的濃度才能誘導(dǎo)靶標(biāo)蛋白質(zhì)降解。然而，受益于共價(jià)連接的可轉(zhuǎn)移PROTAC策略能增加降解的靶標(biāo)親和力以及動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)?？赊D(zhuǎn)移的PROTAC策略僅需要通過(guò)簡(jiǎn)單的配體組裝，用于快速判斷特定靶標(biāo)的降解效率。作者相信，出于不同的目的，不同的功能基團(tuán)可以選擇性標(biāo)記到靶標(biāo)上，用于模擬PTM修飾、活細(xì)胞成像以及化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究等。

北大深研院的王躍娜博士，萬(wàn)川博士和趙融通博士完成了實(shí)驗(yàn)的主要部分，深圳灣實(shí)驗(yàn)室的康微博士，王蕊博士，深圳大學(xué)的江承堯博士對(duì)本論文做出了重要貢獻(xiàn)。論文得到了國(guó)家自然科學(xué)基金，國(guó)家博士后基金，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“合成生物學(xué)”重點(diǎn)專項(xiàng)，廣東省自然科學(xué)基金，深圳市科技創(chuàng)新委員會(huì)的支持。

論文鏈接https://doi.org/10.31635/ccschem.022.202201985

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