Nature Methods｜新一代乙酰膽堿探針實(shí)現(xiàn)體內(nèi)乙酰膽堿信號(hào)的精確解析
神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜行為背后，不同神經(jīng)元之間如何進(jìn)行有效地信息傳遞和整合，以及信息傳遞的異常是否導(dǎo)致特定疾病的發(fā)生，均是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵問(wèn)題。乙酰膽堿作為經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)，是神經(jīng)元之間信息溝通的關(guān)鍵媒介分子，其參與了生長(zhǎng)發(fā)育、感知及運(yùn)動(dòng)、心血管功能、高級(jí)認(rèn)知如學(xué)習(xí)記憶等諸多重要生理功能的調(diào)控 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 1-3。由于神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性和乙酰膽堿的功能多樣性，精確解析乙酰膽堿信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化，如特定神經(jīng)元是否在行為的某個(gè)階段釋放或接收乙酰膽堿信號(hào)，可以幫助我們進(jìn)一步了解乙酰膽堿的生理學(xué)意義。同時(shí)，探究乙酰膽堿信號(hào)在阿茲海默癥、心血管疾病、腫瘤等疾病中的變化，也有助于探究和解析疾病的發(fā)病機(jī)理或臨床癥狀的成因。
2020年9月28日，北京大學(xué)李毓龍實(shí)驗(yàn)室和北京腦科學(xué)與類腦研究中心井淼實(shí)驗(yàn)室合作，在Nature Methods雜志以Article形式在線發(fā)表了題為“An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity”的研究論文，報(bào)道了新一代高靈敏乙酰膽堿熒光探針的開(kāi)發(fā)及其在多種模式生物中的成功應(yīng)用。
應(yīng)用光學(xué)成像的方法檢測(cè)乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)在近年來(lái)取得了巨大的突破，這主要得利于新型熒光探針的開(kāi)發(fā)及其廣泛應(yīng)用。自2018年起，北京大學(xué)李毓龍等課題組首次應(yīng)用G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）作為蛋白骨架，構(gòu)建了一系列可以精確檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)動(dòng)態(tài)變化的熒光探針，即GPCR-Activation Based (GRAB)探針 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 4-7。結(jié)合光學(xué)成像手段，GRAB探針系列目前已在多項(xiàng)工作中成功實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)及其功能在活體動(dòng)物中的進(jìn)一步解析 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 8-10。在本工作中，研究者基于已發(fā)表的第一代GRAB乙酰膽堿探針進(jìn)一步進(jìn)行突變篩選和理性設(shè)計(jì)，成功獲得了對(duì)乙酰膽堿具有約300%熒光信號(hào)響應(yīng)的新版本探針（ACh3.0），其在信號(hào)幅度上相比第一代探針有3倍以上的提升，且仍保持著對(duì)乙酰膽堿的分子特異性和亞秒級(jí)的動(dòng)力學(xué)特性。更重要的是，通過(guò)對(duì)探針進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化，ACh3.0探針在結(jié)合乙酰膽堿后不會(huì)激活內(nèi)源的信號(hào)通路，這使得探針可以安全地作為“檢測(cè)器”表達(dá)于細(xì)胞上，而不會(huì)對(duì)細(xì)胞本身的生理功能帶來(lái)影響。綜合而言，新版本的探針在檢測(cè)乙酰膽堿方面兼具了細(xì)胞特異性表達(dá)、高靈敏性、高親和力、快速反應(yīng)速率以及高選擇性，這為其在活體內(nèi)精確解析乙酰膽堿的動(dòng)態(tài)變化奠定了基礎(chǔ)。
圖一：新一代乙酰膽堿探針的開(kāi)發(fā)及其刻畫(huà)。
a: 針對(duì)乙酰膽堿探針的關(guān)鍵位置進(jìn)行突變篩選成功獲得新一代探針ACh3.0，其在信號(hào)幅度和基礎(chǔ)亮度上都顯著優(yōu)于已發(fā)表的ACh2.0探針。同時(shí)，針對(duì)受體結(jié)合乙酰膽堿位點(diǎn)的突變獲得對(duì)照探針ACh3.0-mut，可在活體應(yīng)用中作為陰性對(duì)照證明乙酰膽堿信號(hào)的特異性。
b: 不同版本乙酰膽堿探針在培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)乙酰膽堿的熒光響應(yīng)。
在對(duì)乙酰膽堿探針進(jìn)行優(yōu)化和一系列刻畫(huà)后，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在多種模式生物中應(yīng)用了探針，并成功地檢測(cè)了內(nèi)源的乙酰膽堿在不同腦區(qū)的釋放及其調(diào)控。如在轉(zhuǎn)基因果蠅中研究團(tuán)隊(duì)揭示了活體果蠅在接受不同生理刺激時(shí)，嗅覺(jué)中樞蘑菇體存在區(qū)域特異性的乙酰膽堿釋放。在活體小鼠中，研究者成功記錄到了在包括杏仁核、海馬、皮層等不同腦區(qū)中，多種行為過(guò)程中乙酰膽堿的動(dòng)態(tài)變化，這將對(duì)進(jìn)一步研究乙酰膽堿的生理和病理功能提供重要工具。
圖二：新一代乙酰膽堿探針在果蠅及小鼠中的成功應(yīng)用。
a: 應(yīng)用新一代乙酰膽堿探針ACh3.0觀測(cè)到活體果蠅嗅覺(jué)中樞中，特定生理刺激引發(fā)的區(qū)域特異性乙酰膽堿信號(hào)變化。其中，ACh3.0相比于ACh2.0具有明顯提高的活體檢測(cè)靈敏度。
b: 新一代乙酰膽堿探針ACh3.0記錄到小鼠基底外側(cè)杏仁核（BLA）處在小鼠受到電擊刺激時(shí)的乙酰膽堿釋放。研究者應(yīng)用對(duì)照探針ACh3.0-mut或特異性敲除乙酰膽堿囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體VAChT的小鼠作為對(duì)照，證明檢測(cè)到的熒光信號(hào)為乙酰膽堿濃度變化導(dǎo)致。
北京腦科學(xué)與類腦研究中心的井淼博士為本文章的第一作者，井淼博士與北京大學(xué)李毓龍博士為文章的共同通訊作者。北京大學(xué)已畢業(yè)本科生李玥璇及CLS項(xiàng)目博士生曾健智、錢(qián)統(tǒng)瑞、潘孫磊等對(duì)文章做出了重要貢獻(xiàn)。國(guó)內(nèi)外合作團(tuán)隊(duì)包括中科院神經(jīng)科學(xué)研究所徐敏實(shí)驗(yàn)室、華中科技大學(xué)李浩洪實(shí)驗(yàn)室、北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所陳良怡實(shí)驗(yàn)室和程和平實(shí)驗(yàn)室、加拿大西安大略大學(xué)Marco Prado, Lisa Saksida, Vania Prado和Tim Bussey實(shí)驗(yàn)室，以及美國(guó)南加州大學(xué)Andrew Hires實(shí)驗(yàn)室。該研究受到北京大學(xué)膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家自然科學(xué)基金、美國(guó)腦計(jì)劃、腦科學(xué)與類腦研究北方科學(xué)中心地方配套科研項(xiàng)目等支持。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0953-2
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