陳興課題組揭示軍團菌來源的新型O-糖基轉移酶機理
2019年1月8日，北京大學化學與分子工程學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心陳興教授課題組在Nature Chemical Biology雜志在線發(fā)表了題為“Legionella effector SetA as a general O-glucosyltransferase for eukaryotic proteins”（DOI: 10.1038/s41589-018-0189-y）的研究論文，報道通過化學酶法標記策略，實現(xiàn)了對嗜肺軍團菌效應蛋白糖基轉移酶SetA的蛋白底物鑒定，并闡明了SetA的底物選擇機理，為糖蛋白的人工合成提供了一種有力的工具。
糖基化修飾是一種廣泛存在且重要的蛋白質翻譯后修飾，由糖基轉移酶催化形成?？贵w、疫苗等許多臨床治療性蛋白質都具有特異性糖基化修飾，且對蛋白活性至關重要?；谔腔D移酶的化學酶法合成方法，是獲得均一糖蛋白的有效手段之一。因此，找尋性質優(yōu)良的各種糖基轉移酶十分關鍵。對比真核細胞，細菌來源的糖基轉移酶具有易表達純化和催化產(chǎn)率高等優(yōu)良性質，常被改造為人工合成糖蛋白的工具酶。然而，蛋白O-連接糖基化修飾在原核生物與真核生物之間并不保守，這成為了利用細菌糖基化系統(tǒng)生產(chǎn)真核生物O-糖蛋白的一大瓶頸。為了解決這個問題，陳興教授課題組對病原菌-宿主相互作用中的蛋白質糖基化進行了探索。
某些病原菌入侵宿主細胞后，會分泌具有糖基轉移酶活性的效應蛋白。這些效應蛋白往往利用宿主的糖供體，并且修飾宿主的靶蛋白。因此，對這類糖基轉移酶的工程化，可為實現(xiàn)真核生物O-糖蛋白的合成提供新的有效策略。嗜肺軍團菌效應蛋白SetA具有O-葡萄糖轉移酶活性，然而其底物蛋白尚未被鑒定。陳興課題組首先開發(fā)了能夠實現(xiàn)特異性標記和選擇性富集的化學酶法策略。他們設計被SetA利用的生物正交基團修飾的糖供體（尿苷二磷酸-6-疊氮-葡萄糖，UDP-6AzGlc），將疊氮葡萄糖6AzGlc轉移至底物蛋白。通過點擊化學反應，與可切割生物素探針連接，實現(xiàn)對底物蛋白的選擇性富集和位點特異性質譜鑒定(下圖)。質譜分析鑒定到分布于276個蛋白的317個O-glucose修飾位點。天然糖供體標記及軍團菌侵染實驗，驗證了SetA可以修飾眾多的底物蛋白。
化學酶法標記策略流程示意圖
進一步研究發(fā)現(xiàn)被修飾蛋白具有S/T#-X-L-P/G (#為修飾氨基酸)序列保守性。核心催化結構域的結構模型表面，糖供體結合口袋鄰近處的疏水區(qū)域參與了SetA的底物選擇。隨后，研究人員將SetA選擇性識別的S/T-X-L-P/G保守性序列，開發(fā)為O-glucosylation 標簽 (GlcTag)，實現(xiàn)了真核生物蛋白的位點特異性O-糖基化修飾(下圖)。
SetA識別S/T-X-L-P/G保守序列
綜上所述，這項研究開發(fā)了化學酶法標記策略，實現(xiàn)了對軍團菌效應蛋白糖基轉移酶SetA的底物蛋白鑒定，揭示了SetA的底物修飾具有S/T-X-L-P/G序列選擇性。首次發(fā)現(xiàn)了原核生物中廣譜O-糖基化系統(tǒng)，為糖蛋白的人工合成提供了有力的工具。該化學酶法標記富集策略可推廣應用到多種糖基轉移酶的底物蛋白鑒定，促進更多的糖合成工具酶的開發(fā)，進而實現(xiàn)各種糖蛋白的精準合成。
北大-清華生命科學聯(lián)合中心博士研究生高玲為本論文第一作者。陳興教授通訊聯(lián)系作者。北大化學院來魯華教授，北京生命科學研究所邵峰研究員和北大生科院肖俊宇研究員參與了該研究。該研究工作得到了國家自然科學基金委、科技部、北大-清華生命科學聯(lián)合中心的資助。
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