張文彬課題組發(fā)展蛋白質(zhì)訂書(shū)機(jī)酶實(shí)現(xiàn)高效多肽-多肽偶聯(lián)反應(yīng)
高效的多肽-多肽偶聯(lián)反應(yīng)對(duì)于制備蛋白-藥物綴合物、調(diào)控蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、生物成像、化學(xué)生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要的意義，并因其可基因編碼的特性而備受關(guān)注。目前，研究報(bào)道此類(lèi)連接方法并不太多見(jiàn)，其中分選酶（sortase）或蝶豆粘酶-1（butelase 1）介導(dǎo)的偶聯(lián)反應(yīng)具有較好的底物序列特異性，內(nèi)含肽（intein）介導(dǎo)的蛋白質(zhì)連接方法可實(shí)現(xiàn)可基因編碼的高效主鏈連接，而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase）則可以介導(dǎo)非特異性的側(cè)鏈異肽鍵偶聯(lián)。近年來(lái)，多肽-蛋白質(zhì)反應(yīng)對(duì)的蓬勃發(fā)展為此類(lèi)工具的發(fā)展提供了新的契機(jī)。已有諜連接酶（SpyLigase）和探連接酶（SnoopLigase）介導(dǎo)的多肽-多肽偶聯(lián)體系見(jiàn)諸報(bào)道，但其效率仍有待提高，而其細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用前景仍有待探索。最近，張文彬課題組發(fā)展了獨(dú)特的具有無(wú)序結(jié)構(gòu)的諜訂書(shū)機(jī)酶（SpyStapler），可實(shí)現(xiàn)諜標(biāo)簽（SpyTag）和北大標(biāo)簽（BDTag）在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的高效偶聯(lián)（圖1）。
圖1. 諜訂書(shū)機(jī)介導(dǎo)的多肽-多肽偶聯(lián)反應(yīng)
該研究基于對(duì)諜標(biāo)簽-諜捕手（SpyCatcher）復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析，將諜捕手從其結(jié)構(gòu)中第二個(gè)較為柔性的環(huán)區(qū)進(jìn)行拆分，得到北大標(biāo)簽和諜訂書(shū)機(jī)酶。研究表明，諜訂書(shū)機(jī)酶在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中均可促進(jìn)諜標(biāo)簽和北大標(biāo)簽之間形成異肽鍵，在較溫和的條件下即可達(dá)到超過(guò)80 %的產(chǎn)率（PBS，4 oC）。該偶聯(lián)方法可被用于蛋白質(zhì)拓?fù)涔こ蹋ㄟ^(guò)細(xì)胞外反應(yīng)制備四臂的星型彈性蛋白以及環(huán)狀的二氫葉酸還原酶。值得注意的是，諜訂書(shū)機(jī)酶在細(xì)胞內(nèi)也可以高效工作，只要通過(guò)共表達(dá)線(xiàn)型的反應(yīng)性二氫葉酸還原酶和諜訂書(shū)機(jī)酶，就可以直接在細(xì)胞內(nèi)原位定量實(shí)現(xiàn)環(huán)化（圖2）。通常，酶需要穩(wěn)定而有序的折疊結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)其功能。諜訂書(shū)機(jī)酶與之形成鮮明對(duì)比。圓二色光譜和核磁共振波譜都證實(shí)諜訂書(shū)機(jī)酶在溶液中完全無(wú)序，并不存在一個(gè)穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)。只有在諜標(biāo)簽和北大標(biāo)簽同時(shí)存在的情況下，它才能形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。也正因?yàn)樗幕钚圆灰蕾?lài)于預(yù)先存在的有序結(jié)構(gòu)，諜訂書(shū)機(jī)酶可以耐受加熱、反復(fù)凍融、化學(xué)變性等處理，而不失去其活性。諜訂書(shū)機(jī)體系的高反應(yīng)效率和獨(dú)特的穩(wěn)定性為多肽-多肽偶聯(lián)以及蛋白質(zhì)拓?fù)涔こ烫峁┝诵碌墓ぞ摺?/p>
圖2. （a）諜訂書(shū)機(jī)酶可介導(dǎo)位于柔性鏈中的多肽標(biāo)簽之間的偶聯(lián)，形成四臂星型彈性蛋白；（b）在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)反應(yīng)性DHFR和諜訂書(shū)機(jī)酶，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的原位環(huán)化。
該研究近期在線(xiàn)發(fā)表于Journal of the American Chemical Society（https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.8b08250）。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士生吳夏泠和劉雅杰為該論文共同第一作者，張文彬研究員為論文通訊作者。香港科技大學(xué)的孫飛教授亦參與了該研究。該工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、863計(jì)劃、北京大學(xué)跨學(xué)科醫(yī)學(xué)種子基金以及吉林大學(xué)超分子結(jié)構(gòu)與材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題的資助。
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