陳鵬課題組發(fā)展細(xì)胞互作的原位捕獲技術(shù)
近日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳鵬教授課題組以“Enzyme-Mediated Intercellular Proximity Labeling for Detecting Cell–Cell Interactions”為題在J. Am. Chem. Soc.雜志報(bào)道了一種能夠在活體和原位情況下捕獲細(xì)胞之間相互作用的技術(shù)；美國(guó)化學(xué)會(huì)C&E NEWS于2月12日以“New labeling method can reveal cell-cell interactions”為題進(jìn)行了專(zhuān)題報(bào)道。
不同細(xì)胞之間的相互作用和信息傳遞在包括免疫響應(yīng)、器官發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)在內(nèi)的眾多生命活動(dòng)中都扮演著關(guān)鍵角色。目前，研究細(xì)胞互作的方法大都需要已知參與的細(xì)胞類(lèi)型，難以在復(fù)雜的活體環(huán)境下發(fā)現(xiàn)或研究未知的細(xì)胞間相互作用。為了解決這一難題，陳鵬課題組借助“定向進(jìn)化”技術(shù)和“鄰近標(biāo)記”策略，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞之間動(dòng)態(tài)相互作用的原位捕獲。這一被命名為EXCELL（Enzyme-mediated proximal cell labeling）的技術(shù)，通過(guò)將作者定向進(jìn)化得到的分選酶（mgSrtA）展示在待研究的細(xì)胞表面，能夠?qū)εc其相互作用的細(xì)胞進(jìn)行原位捕獲與鑒定，為研究細(xì)胞-細(xì)胞相互作用提供了有力的工具。
圖 1 EXCELL方法用于捕獲和鑒定細(xì)胞間相互作用
源自金黃色葡萄球菌的分選酶Sortase A （SrtA）能夠催化分選肽（LPETG）和寡聚甘氨酸的共價(jià)連接。近期有文獻(xiàn)報(bào)道將SrtA用于監(jiān)測(cè)小鼠體內(nèi)特定受體-配體介導(dǎo)的免疫細(xì)胞互作過(guò)程1。但是該方法需要將SrtA與寡聚甘氨酸分別融合在相互作用的配體和受體細(xì)胞上，因此需要預(yù)知相互作用的細(xì)胞類(lèi)型，并對(duì)兩類(lèi)細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行基因改造，因此無(wú)法捕捉未知的細(xì)胞間相互作用。為了突破這一瓶頸，陳鵬課題組設(shè)想獲得一種針對(duì)未知細(xì)胞的標(biāo)記方法。由于細(xì)胞表面蛋白中有大約5％含有N端單一甘氨酸，受此啟發(fā)，他們希望獲得一種對(duì)單個(gè)甘氨酸的N端氨基進(jìn)行標(biāo)記的分選酶，從而能夠?qū)θ我饧?xì)胞加以標(biāo)記。為此他們建立了對(duì)SrtA進(jìn)行定向進(jìn)化的高通量熒光篩選平臺(tái)，并成功獲得了對(duì)單一甘氨酸進(jìn)行標(biāo)記的高活性SrtA突變體-mgSrtA，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)任意細(xì)胞類(lèi)型的有效標(biāo)記。
作者分別借助親和體-抗原（ZHER與Her2）和配體-受體（CTLA4與B7, CD40L與CD40）的相互作用來(lái)驗(yàn)證該方法的可靠性。實(shí)驗(yàn)證明展示在細(xì)胞表面的mgSrtA可借助鄰近效應(yīng)，將含有 biotin標(biāo)簽的分選肽biotin-LPETG共價(jià)標(biāo)記在與其相互作用的細(xì)胞表面。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，能夠發(fā)現(xiàn)biotin標(biāo)記信號(hào)僅在相互作用細(xì)胞上有顯著性增強(qiáng)，由此可成功區(qū)分和捕獲發(fā)生相互作用的細(xì)胞。
圖 2在兩類(lèi)細(xì)胞相互作用模型上應(yīng)用EXCELL，可實(shí)現(xiàn)對(duì)互作細(xì)胞的有效標(biāo)記
該方法首次將SrtA改造成高活性且具有更寬泛底物譜的“鄰近標(biāo)記”酶，并驗(yàn)證其對(duì)細(xì)胞相互作用的標(biāo)記和追蹤。文中指出，EXCELL方法無(wú)需將寡聚甘氨酸事先引入到對(duì)象細(xì)胞表面，因此適用于研究復(fù)雜體系中未知細(xì)胞類(lèi)型的相互作用。同時(shí)，鑒于SrtA底物分選肽僅含五個(gè)氨基酸，并已成功應(yīng)用于小鼠體內(nèi)。該標(biāo)記方法不僅易于監(jiān)測(cè)，在未來(lái)還可以與多種下游分析平臺(tái)兼容，完成對(duì)相互作用細(xì)胞的捕獲、富集和測(cè)序，從而進(jìn)一步得出細(xì)胞間相互作用在時(shí)間、空間、類(lèi)型等多方面的信息。
近年來(lái)，一系列蛋白質(zhì)鄰近標(biāo)記技術(shù)被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究, 此次開(kāi)發(fā)的EXCELL技術(shù)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞互作的原位標(biāo)記與捕獲，將鄰近標(biāo)記策略從“胞內(nèi)”拓展至“胞外”空間，將在免疫應(yīng)答、神經(jīng)傳導(dǎo)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。陳鵬教授為該論文的通訊作者，課題組博士畢業(yè)生葛韻、陳龍為共同第一作者。該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部和北京大學(xué)合成與功能生物分子中心的資助。
原文鏈接：
https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/jacs.8b10286
C&E NEWS鏈接：
https://cen.acs.org/biological-chemistry/biochemistry/New-labeling-method-reveal-cell/97/web/2019/02
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